一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用

1.本发明涉及组织工程技术领域，特别是一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用。


背景技术：

2.鹿茸是唯一可以完全再生的哺乳动物器官。且其生长速度可达2cm/d，被公认为哺乳动物组织中最快生长的骨形式，并且是由软骨到骨的形式形成。鹿茸完全再生和快速生长能力主要由于鹿茸干细胞的存在。因此鹿茸干细胞可能在骨/软骨的再生中起到关键作用。经鉴定，鹿茸干细胞为介于胚胎干细胞和间充质干细胞之间的一种特殊的干细胞类型。与目前所常用的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等干细胞相比，鹿茸干细胞更易于获取，增殖速度快，分泌大量的细胞因子和生物活性因子。
3.软骨是由软骨细胞和细胞基质构成，一旦软骨出现损伤，其自我修复能力非常有限，如果不治疗将最终导致骨关节炎的发生。对于软骨缺损的治疗方法常见的有微骨折、软骨移植、人工骨关节置换等治疗方法，但其治疗效果仍有待提升。随着组织工程的发展，使用支架材料来修复软骨缺损的方法越来越受到研究者的重视。组织工程包括种子细胞、支架材料、生长调节因子三要素，其中合适的支架材料是成功修复组织的前提条件。在过去的几年里，各种组织来源的脱细胞外基质(extracellular matrix，ecm)生物支架材料由于去除抗原性成分保留生理结构蛋白，在临床前动物实验和临床上均有应用，但目前尚无公认的理想支架材料。为了寻找更多可以利用的生物支架，用细胞衍生的细胞外基质作为支架是近年来的一种崭新的方法。组织衍生的细胞外基质由于不同组织的功能不同，造成在不同的组织成分有很大不同，其天然结构非常复杂。而用细胞衍生的细胞外基质来制作支架，与组织衍生的细胞外基质支架相比，具有极强的仿生结构、可塑性、无免疫源性等特点，因此细胞衍生的细胞外基质支架为组织工程提供了新的方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种鹿茸干细胞细胞外基质及其制备方法和运用；本发明结合鹿茸干细胞在完全再生鹿茸组织的优势，将鹿茸干细胞通过培养衍生鹿茸干细胞细胞外基质，并将制备的细胞外基质膜用于软骨缺损修复，取得了良好的效果，为组织工程生物材料提供新的选择。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
6.一种鹿茸干细胞细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
7.s1将原代鹿茸干细胞培养至3-5代，其后接种到培养皿中，加入传代培养液进行培养；
8.s2当细胞培养至80％汇合时，更换为含有40ug/ml～60ug/ml抗坏血酸的dmem完全培养基继续培养，培养过程中，每两天换液一次，待培养至细胞外基质沉积成膜状时，分离细胞外基质；
9.s3将分离的细胞外基质先用pbs洗涤，再放入含有20mm nh4oh的0.5％triton x-100的液体中进行处理，其后在37℃的培养箱中用含有dna酶的核酸清除液进行处理候，去除细胞核，即得所述鹿茸干细胞细胞外基质。
10.优选的，所述原代鹿茸干细胞的制备步骤如下：
11.s01采集鹿生茸区骨膜组织，将其置于含有双抗的dmem中；其后将鹿生茸区骨膜组织取出，使用pbs溶液反复清洗直至完全去除血污，然后在一次性无菌平皿中，使用手术刀将鹿生茸区骨膜组织切成若干碎块；
12.s02取2-4g所述碎块用洗涤液洗涤，然后转入50ml离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集第一沉淀；
13.s03向所述第一沉淀中加入30ml消化液，在37℃条件下震荡进行消化，每间隔10min在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化；其后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，再加10ml dmem原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集第二沉淀；
14.s04取所述第一沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3ml的dmem原代培养液，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合时，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞。
15.优选的，所述鹿茸生茸区骨膜组织采集于鹿生茸区未开始发育的1岁龄公鹿的额外嵴生茸区。
16.优选的，所述步骤s02中的洗涤液为含双抗的pbs，有助于抑制现场采样后的细菌对后续实验结果的污染。
17.优选的，所述步骤s03中的消化液为50u/ml的ⅰ型胶原酶溶液。骨膜组织是骨表面一层坚固的结缔组织，使用i型胶原消化其中的胶原纤维，使细胞更容易从组织中取出。
18.优选的，所述步骤s04中的原代培养液为含20％fbs、含1％抗生素的dmem培养液。本方案中，通过给细胞提供营养，促进细胞生长。
19.优选的，所述步骤s04中的胰蛋白酶的浓度为0.25％消化。
20.优选的，所述步骤s1中，传代培养液为含10％fbs、含1％抗生素的dmem培养液。
21.优选的，所述步骤s3中，需使用dapi核酸染料对去细胞核后的ecm进行检测；
22.具体操作步骤是：将去细胞核后的ecm用固定液固定15min后用pbs洗三次，加入1ml dapi染料，染色5min后去除染料，其后用pbs洗3次后用显微镜观察是否有荧光。
23.以上述制备方法制得的鹿茸干细胞细胞外基质为基础，本发明还进一步提供了一种鹿茸干细胞细胞外基质在制备修复再生骨或软骨损伤药物中的应用。
24.本发明的有益效果是：
25.1.本发明首次选择鹿茸干细胞作为原材料，在细胞培养皿中诱导细胞分泌大量细胞外基质形成细胞外基质膜，通过去细胞处理后，获得鹿茸干细胞细胞外基质，并用于修复软骨；本发明通过去细胞处理，能够避免引起免疫应急等问题，在软骨修复中取得良好的修复效果；同时，该细胞外基质用于修复软骨解决了异种干细胞用于临床的免疫排斥等相关伦理问题，因此鹿茸干细胞细胞外基质可以作为一种天然组织工程支架材料，为组织工程生物材料提供新的选择。
26.2.现有技术中，采用鹿茸组织为材料通过去细胞处理后制成鹿茸组织细胞外基质，用于修复兔关节软骨缺损，但组织脱细胞基质的制备过程繁杂，且鹿茸原材料相较细胞较难获取，且受鹿茸生长季节的限制，因此，采用鹿茸组织细胞外基质用于修复关节软骨难以推广；本发明采用鹿茸干细胞细胞外基质相较于鹿茸组织细胞外基质有以下效果：
①
鹿茸干细胞增殖速度快，可以通过细胞培养获得，因此原材料来源丰富；
②
制备过程简单；
③
修复再生骨或软骨损伤的效果更好。
附图说明：
27.图1：本发明制备的鹿茸干细胞细胞外基质；
28.图2：12周时对照组大鼠软骨缺损修复结果；
29.图3：12周时大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质修复大鼠软骨缺损结果；
30.图4：12周时鹿茸干细胞细胞外基质修复大鼠软骨缺损结果。
具体实施方式
31.下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下。
32.实施例
33.s01麻醉鹿生茸区未开始发育的1岁龄公鹿，麻醉后对额外嵴生茸区进行备皮，消毒，并在无菌环境下，切开生茸区皮肤，暴露生茸区骨膜，清理掉疏松结缔组织，然后用干净的手术刀沿着生茸区(额外嵴最低处)进行切割，然后用鼠牙镊子将切割的骨膜从骨质上撕下来，迅速放入含双倍双抗的dmem培养基中，其后用无菌镊子取出，使用pbs溶液反复清洗，直至完全去除血污；然后在一次性无菌平皿中，用无菌的小铡刀将鹿生茸区骨膜组织切成若干体积约0.7mm3碎块；
34.s02取2-4g所述碎块，用不含fbs、含双倍双抗(200u/ml)的dmem液洗涤，然后转入50ml离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液后，得到第一沉淀；
35.s03向所述第一沉淀中加入30ml消化液(50u/ml胶原酶ⅰ)，在37℃中轻微震荡进行消化，每间隔10min在显微镜下观察消化情况，在当大多数组织块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化；其后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液后，再加10ml含20％fbs、含1％抗生素的dmem原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液后，得到第二沉淀；
36.s04取所述第二沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3ml含20％fbs、含1％抗生素的dmem原代培养液，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合时，将细胞用0.25％胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化2-3min，细胞收缩变圆后，停止消化，获得原代鹿茸干细胞(apcs)。
37.s1将原代鹿茸干细胞用传代培养基进行传代培养，传至3-5代，然后将3
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105个细胞接种到100cm2培养皿中，加入15ml含10％fbs、含1％抗生素的dmem传代培养液进行培养；
38.s2当细胞培养至80％汇合时，更换为含有50ug/ml抗坏血酸的dmem完全培养基继续培养，培养过程中，每两天换液一次，培养14天后细胞外基质沉积成膜状，即可分离细胞外基质；
39.s3将分离的细胞外基质先用pbs洗涤3次，再放入含有20mm nh4oh的0.5％triton x-100的液体中处理2h，其后在37℃的培养箱中用含有dna酶的核酸清除液处理4h，然后去除细胞核，即得所述鹿茸干细胞细胞外基质(apcs-ecm)，如图1所示。本发明制备方法简便，且制得的鹿茸干细胞细胞外基质纯度高、品质高。
40.对比例
41.取大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)，使用与鹿茸干细胞细胞外基质相同的制备方法制备大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质(bmscs-ecm)，作为同种异体干细胞来源的细胞外基质的阳性对照组。
42.实验例
43.(1)将获得的鹿茸干细胞细胞外基质用于大鼠软骨缺损修复。
44.使用健康成年雄性sd大鼠18只，10周龄，体重为260
±
10g，分笼饲养，自由饮食饮水，保持饲养环境温度为22℃～25℃，湿度为40％～60％，按随机分3组，每组6只。
45.手术方法如下：大鼠腹腔注射0.7ml水合氯醛麻醉，使用脱毛膏将手术部位大鼠膝关节外被毛去掉，用75％的酒精对表面皮肤进行消毒。在膝关节内侧用手术刀纵向切开一个约3cm的切口，钝性分离皮下筋膜，再用手术刀切开肌肉，暴露出关节腔，将髌骨向外侧脱位，显露股骨滑车部位，用钻头直径为2.0mm的电钻在滑车部中央部分做一个直径为2.0mm，深约为2mm的全层骨软骨缺损。
46.按照如下实验分组：
47.对照组：造成关节软骨缺损后，复位髌骨，然后逐层缝合伤口即可；
48.大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质(bmscs-ecm)组：造成关节软骨缺损后，在缺损处使用对比例制备好的bmscs-ecm进行填充，与四周软骨平齐，然后逐层缝合伤口；
49.鹿茸干细胞细胞外基质(apcs-ecm)组：造成关节软骨缺损后，在缺损处使用实施例制备好的apcs-ecm进行填充，与四周软骨平齐，然后逐层缝合伤口。
50.手术后12周每组取样3只大鼠膝关节做组织学分析。
51.(2)组织学评估大鼠软骨修复结果
52.将样品(每组n＝6)用4％多聚甲醛固定24h，用10％甲酸脱钙10天，每3天换甲酸脱钙液一次、冲洗2h后乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切成5μm石蜡切片，62℃烤片2h。然后将切片用阿利新蓝复合h&e染色对切片进行染色。
53.(3)组织学结果
54.通过使用阿利新蓝复合h&e染色，软骨及软骨类似组织被异染呈蓝色。使用m8电子扫描显微镜观察组织切片可见：
55.对照组中12周时软骨下骨被修复与周围正常软骨下骨融合，但再生组织表面没有蓝色异染组织，即没有软骨细胞和类软骨组织再生，与周围正常软骨有明显区别，如图2所示；
56.大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质(bmscs-ecm)组：12周软骨下骨被修复，软骨表面有软骨层，但再生的软骨较薄，与正常软骨组织有较大差异，再生软骨与正常融合较差，如图3所示；
57.鹿茸干细胞细胞外基质组：12周时再生的软骨组织与正常软骨组织融合，大量蓝色异染细胞在软骨层表达，再生组织中有软骨细胞柱排列，即软骨组织被重塑，如图4所示。
58.通过上述实验可知：虽然鹿茸干细胞细胞外基质和大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质均为同种异体干细胞来源的细胞外基质，但是通过本方法制备的大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质在修复软骨组织方面的性能较差，而通过本发明制备的鹿茸干细胞细胞外基质在修复软骨组织损伤方面能够发挥极为显著的效果，为组织工程生物材料提供新的选择。
59.以上仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。