一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰RNA及其DNA四面体复合物的制作方法

本发明涉及针对新生血管性视网膜疾病的药物领域，具体而言，其涉及沉默runt相关转录因子1(runx1)基因的基因药物领域。

背景技术：

1、新生血管形成(新血管生成)是很多眼部疾病的共同病理改变，常发生于角膜、虹膜、脉络膜和视网膜，导致的疾病包括角膜新生血管、脉络膜新生血管、视网膜新生血管等病变，常见的由此导致的眼部疾患包括例如：糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy，dr)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，rop)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，amd)(包括湿性amd和干性amd，湿性amd的病理改变为脉络膜新生血管)、新生血管性青光眼等。新生血管可以在角膜、虹膜睫状体、脉络膜、视网膜、黄斑及视盘等几乎眼内所有组织中出现，它能够引起这些部位的组织出血、渗出及增生等一系列病理改变，因而造成眼球结构和功能的破坏，严重损害视功能。眼底新生血管性疾病患者人数在4000万以上，且随着人口老龄化程度加重，患者人数还在不断上升。眼底新生血管性疾病的患者几乎每月都要复诊或注射相关药物，否则视力的受损会严重影响生活。已有研究对于上述疾病的病因探究主要集中于因缺血、缺氧等因素触发炎性反应并刺激该区域促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，vegf)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)等产生，诱导脉络膜、视网膜新生血管形成，并迅速增加微血管的通透性，从而导致黄斑水肿、视网膜出血、玻璃体积血等严重危害视力的并发症。

2、runx1又称为aml1，是人类白血病中染色体易位最常见的靶位点。runx1是十分重要的转录因子，在多种造血细胞系中广泛表达，在造血细胞的分化中起着关键作用，亦可调节造血相关基因的表达。runx1基因异常表达和突变常与人类白血病的发生相关。许多研究表明runx1是造血细胞生成过程中重要的调节因子，runx1蛋白可接受多种翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化等，其活性可受这些翻译后修饰的影响，从而调节造血细胞的分化、凋亡及自我更新。

3、近年来，相关研究挖掘出runx1靶点与眼新生血管之间的关系，如文献identification of runx1 as a mediator of aberrant retinal angiogenesis[j].diabetes,2017:1950-1956.中将runt相关转录因子1(runx1)鉴定为通过转录组学分析从人pdr纤维血管膜(fvm)获得的cd31(+)血管内皮细胞中上调的基因。使用人视网膜微血管内皮细胞(hrmecs)的体外研究表明，在高葡萄糖反应中，runx1rna和蛋白质表达增加，而runx1抑制降低了hrmec的迁移，增殖和管形成。runx1的免疫组织化学染色显示，氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中患者来源的fvm血管和血管生成簇的血管生成血管具有反应性，这表明runx1上调是视网膜血管生成异常的标志。文献inhibition of runx1 by the ro5-3335 benzodiazepine derivative reduces aberrant retinal angiogenesis[.investigative ophthalmology&visual science,2017中通过runx1染色定位为新生血管簇表明，它是视网膜血管生成异常中内皮细胞功能的新型特异性调节因子。玻璃体内注射ro5-3335(runx1-cbfβ相互作用抑制剂)与载体处理的幼崽相比，新生血管簇面积显着减少有关。这与缺血区域的显著变化无关，这表明视网膜的正常和异常血管形成之间存在独立调节，用ro5-3335抑制runx1功能可有效减少病理性视网膜新生血管形成。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供靶向runt相关转录因子1(runx1)基因及其同型mrna降解的小干扰rna(sirna)；

2、本发明的另一个目的是提供含有所述sirna的药物组合物；

3、本发明的再一个目的是提供所述sirna或所述含有sirna的药物组合物的用途；

4、本发明的再一个目的是提供一种dna四面体-sirna复合物及其用途。

5、根据本发明的一方面，一种针对特异性靶向并引起rnai诱导的runt相关转录因子1(runx1)及其同种型的mrna降解的小干扰rna(sirna)。该sirna双链可与rna诱导的基因沉默复合物(rna-induced silencing complex，risc)连接在一起，并在与risc结合后，靶向切割特定mrna为10～11个碱基的小片段，从而中断runx1 mrna的翻译过程，沉默其互补基因的表达，下调runx1表达量，从而抑制新血管生成。

6、因此，本发明所述的小干扰rna特异性靶向runt相关转录因子1基因及其同型mrna，通过沉默其互补基因的表达，下调runx1表达量，所述的小干扰rna选自：

7、(a)如seq id no.1所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.2所示的核苷酸组成的反义链；

8、(b)如seq id no.3所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.4所示的核苷酸组成的反义链；和

9、(c)如seq id no.5所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.6所示的核苷酸组成的反义链。

10、本发明所述的药物组合物，含有治疗有效量的所述的小干扰rna。

11、在某些实施方式中，所述sirna包含形成rna双链体的正义rna链和反义rna链。正义rna链包含与靶mrna中约19至约25个连续核苷酸的靶序列相同的核苷酸序列。

12、在某些实施方式中，所述sirna序列，虽然可能与非靶序列共有一定的序列同源性，但仍然充分不同以致对于非靶序列不发生rna沉默。包括与非靶序列具有90％同源性、85％同源性、80％同源性、75％同源性、70％同源性、65％同源性、60％同源性、55％同源性、50％同源性、45％同源性、40％同源性、35％同源性、30％同源性、25％同源性、20％同源性、15％同源性、10％同源性、5％同源性、2％同源性和1％同源性的序列。与非靶序列完全不同源的序列被认为是与序列不互补的。

13、在某些实施方式中，所述sirna可包含部分纯化的rna、大体上纯的rna、合成的rna或重组产生的rna以及与天然存在的rna相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的rna。此类改变可包括非核苷酸材料例如至sirna的末端或至sirna的一个或多个内部核苷酸的添加，包括使sirna抗核酸酶降解的修饰。

14、在某些实施方式中，sirna核苷酸序列为如seq id no:1所示的正义链，如seq idno:2所示的反义链；或如seq id no:3所示的正义链、如seq id no:4所示的反义链；或如seq id no:5所示的正义链、如seq id no:6所示的反义链。

15、本发明的sirna可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，包括但不限于化学合成或重组产生。在某些实施方式中，sirna可使用适当地保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪来化学合成，或者还可使用任何适当的启动子从重组环状或线性dna质粒表达sirna。在某些实施方式中，可利用标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的sirna，或可在体内在新血管形成的区域或附近细胞内表达sirna。

16、本发明第二方面是提供本发明的sirna或含有其的药物组合物在制备预防和/或治疗新生血管性眼科疾病的药物中的应用。所述新生血管性眼科疾病包括但不限于:糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血、中心性渗出性视网膜脉络膜病变和其他血管生成性疾病。

17、本发明第三方面提供了一种治疗新血管生成性眼科疾病(新生血管性眼科疾病)的药物组合物，包括治疗有效量的sirna化合物和药学上可接受的辅料(媒介、载体)，所述sirna核苷酸序列包含如seq id no:1所示的rna正义链，如seq id no:2所示的rna反义链(对应表1中sirna-3)；或如seq id no:3所示的rna正义链、如seq id no:4所示的rna反义链(对应表1中sirna-4)；或如seq id no:5所示的rna正义链、如seq id no:6所示的rna反义链(对应表1中sirna-6)。

18、在某些实施方式中，通过考虑诸如受试者的大小和体重等因素,本领域技术人员可以容易地确定要给予给定受试者的sirna的有效量。所述有效量的sirna是足以引起细胞中的靶mrna的rnai介导的降解的量。临床上有效量是，当给受试者施用时，将通过rna沉默抑制受试者的血管生成的进展的量。

19、根据本发明的再一方面，本发明也提供新血管生成性眼科疾病的治疗方法，特别是视网膜新血管性眼科疾病(新生血管性视网膜疾病)的治疗方法，包括将预防和/或治疗有效量的sirna或含有sirna的药物组合物施用于有需要的个体。

20、在某些实施方式中，可以将sirna或含有sirna的药物组合以预防和/或治疗的有效剂量施用于患眼的整体、局部，特别是玻璃体。制剂方式可以是任何适于眼部局部施用的剂型，包括但不限于注射剂、滴眼剂等。

21、施用所述药物组合物能够降低runx1的基因表达，进而抑制患眼相关部位新血管生成，并促进患眼血管的正常化。

22、dna四面体-sirna复合物

23、目前已有研究的针对amd、dme等眼底新生血管疾病的sirna药物有3款，针对的靶点均为vegf。然而，sirna药物用于治疗有两大挑战：一个是sirna暴露血液会有稳定性问题并造成免疫原性，一个是大分子量负电的sirna无法自己跨膜进入胞内。因此，sirna往往需要通过载体递送入胞来发挥功能，其中使用最丰富的是腺相关病毒载体(aav)递送平台，然而，不断有权威研究表明aav可将外源基因片段插入到染色体上，其是否会影响细胞增殖凋亡等功能甚至最终导致癌变，成为其作为载体平台使用中的隐患。又如非病毒载体质纳米粒(lnp)在目前的药物开发中也有较多使用，但由于存在较严重的过敏反应，因而在注射使用lnp递送系统的药物之前，患者需要使用抗组胺和激素药物控制，因此只适用于罕见病和癌症等严重疾病，对于慢性病使用限制较大。

24、dna四面体(tetrahedral dna nanostructures,tdn)是一种由4条单链dna通过变性和复性进而通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它易于合成，生物相容性高，在先的专利对于tdns在眼科疾病中的用途进行了公开，如专利cn109646450b中披露了tdns在制备治疗角膜损伤的药物中的用途，专利cn112007044b中公开了tdns-mir155复合物及其在制备预防或治疗湿性黄斑病变的药物中的用途，专利cn112843085b中公开了tdns-mir22复合物及其在制备治疗视神经损伤的药物中用途。目前尚未见tdns携载sirna进行眼科疾病的治疗。

25、本发明采用dna四面体作为携带靶向runx1 mrna的sirna的载体系统，其稳定性和安全性优异，不易被核酸酶溶解；无需转染，易于穿过细胞膜，能够增强药物的细胞摄取效果，进而提高sirna对mrna的降解效力，阻止新生血管的生成。在使用浓度下，各种类型的活细胞(如raw264.7细胞和l929成纤维细胞样细胞)均未显示出明显的细胞毒性或不良反应。

26、因此，本发明提供用于治疗新生血管性视网膜疾病的dna四面体药物复合物，所述dna四面体药物复合物包括：

27、(1)小干扰rna，所述小干扰rna特异性靶向runt相关转录因子1基因及其同型mrna，沉默runx1互补基因的表达，下调runx1表达量，所述的小干扰rna选自：

28、(a)如seq id no.1所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.2所示的核苷酸组成的反义链；

29、(b)如seq id no.3所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.4所示的核苷酸组成的反义链；和

30、(c)如seq id no.5所示的核苷酸组成的有义链和如seq id no.6所示的核苷酸组成的反义链；以及

31、(2)一dna四面体，所述dna四面体由四条单链dna经碱基互补配对形成；所述四条单链dna的核苷酸序列分别一对一地选自如seq id no.7～10的所示序列；

32、其中所述小干扰rna与dna四面体的至少一条单链连接。

33、优选地，其中将所述小干扰rna的有义链通过化学键与所述dna四面体的至少一条单链连接。

34、优选地，其中在所述小干扰rna的有义链与所述dna四面体的至少一条单链之间还包含一接头。

35、更优选地，其中所述接头为连接序列-ttttt-。

36、本发明所述的的dna四面体药物复合物的制备中，将形成所述dna四面体的四条单链dna以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性，然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成dna四面体结构；将所述四条单链dna的至少一条连接所述小干扰rna。

37、在一个较佳实施方案中，本发明所述的dna四面体，也即tdns，是4条单链dna经碱基互补配对形成；所述4条单链dna的序列依次对应seq id no.7-10的所述序列，其可通过变性、退火过程组装形成目标产物tdns。具体而言，将tdns的4条单链dna置于足以使其变性的温度下维持10min，再将温度降低至2-8℃维持20min以上。

38、在某些实施方式中，dna四面体和sirna按照1:(1-4)的摩尔比构成。所述dna四面体中的至少任意一条dna单链的末端与所连接sirna的正义链连接。

39、在某些实施方式中，所述dna四面体的单链dna与sirna正义链之间还含有连接序列，所述连接序列为核苷酸序列，优选为脱氧核糖核苷酸序列，更优选为-ttttt-,所述-ttttt-序列即连续5个胸腺嘧啶脱氧核苷酸序列。

40、在本发明的一个较佳实施方案中，还提供了一种tdns-sirna核酸分子的制备方法，它是将dna四面体的4条dna单链置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上，其中所述4条单链的至少1条连接有靶向沉默runx1的sirna。

41、优选地，所述dna四面体是由所述4条dna单链经90～98℃变性10～15min、2～8℃退火20～30min制备而成，其中1条连接有靶向沉默runx1的sirna。

42、更优选地，所述dna四面体是由所述4条dna单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成，其中1条连接有靶向沉默runx1的sirna。

43、本发明的又一方面，还提供了上述的tdns-sirna核酸分子在制备预防和/或治疗新血管生成性眼科疾病的药物中的用途，特别是在制备预防和/或治疗视网膜新血管生成性疾病的药物中的用途。

44、在某些实施方式中，所述新血管生成性眼科疾病包括但不限于：糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血、中心性渗出性视网膜脉络膜病变和其他血管生成性疾病。

45、本发明还提供了一种治疗新血管生成性眼科疾病的药物组合物，所述药物组合物含有上述预防和/或治疗新血管生成性眼科疾病的tdns-sirna核酸分子和药学上可接受的辅料(媒介、载体)。

46、在某些实施方式中，通过考虑诸如受试者的大小和体重等因素,本领域技术人员可以容易地确定要给予给定受试者的tdns-sirna的有效量。所述有效量是足以引起细胞中的靶mrna的rnai介导的降解的量。临床上有效量是，当给受试者施用时，将通过rna沉默抑制受试者的血管生成的进展的量。

47、根据本发明的再一方面，本发明也提供与新血管生成性眼科疾病的治疗方法，包括将预防和/或治疗有效量的tdns-sirna或含有tdns-sirna的药物组合物施用于有需要的个体。

48、在某些实施方式中，可以将tdns-sirna或含有tdn-sirna的药物组合以预防和/或治疗的有效剂量施用于患眼的整体、局部，特别是玻璃体。制剂方式可以是任何适于眼部局部施用的剂型，包括但不限于注射剂、滴眼剂等。

49、有益的效果

50、本发明所提供的sirna能引起rnai介导的runt相关转录因子1(runx1)mrna的翻译过程，从而抑制或沉默其互补基因的表达，下调runx1表达，将sirna用于制备治疗新血管生成性眼科疾病的药物，具有十分良好的应用前景。

51、本发明首次将sirna与tdns设计成具有空间四面体结构的tdns-sirna核酸分子，增加了稳定性，帮助sirna高效入胞，提高sirna对runx1 mrna的降解效力，从而减少runx1的表达，阻止新生血管的生成。