一种高稳定性耐乙醇型甘露糖异构酶及其编码基因

1.本发明涉及酶工程领域，具体的说就是一种高稳定性耐乙醇型甘露糖异构酶及其编码基因，该酶能够有效地转化果糖产生甘露糖，尤其在强碱性和低浓度乙醇存在下仍具有很高的相对活性。


背景技术：

2.甘露糖是自然界常见的一种单糖，该糖分子量180，与果糖和葡萄糖属同分异构体，微溶于乙醇，易溶于水。该糖的结晶为白色粉末，具有蔗糖70％的甜度，并略带微苦的后味。甘露糖在多个领域应用广泛，其中作为保健食品可以调节甜味，并且适于广大糖尿病和肥胖症人群的日常饮食。甘露糖还可应用于动物饲料，对家禽肠道病原微生物的增殖有一定的抑制作用。同时，甘露糖具有免疫调节、抗炎等功能，在免疫调节和糖蛋白的合成上具有重要作用(hu x et al.comprehensive reviews in food science and food safety,2016,15(4):773-785)。目前，甘露糖的制备方法分为化学法和生物酶法两大类。其中化学方法需要高温反应，副产物多，而且多种化学原料的需求导致其成本高昂。生物酶法是以果糖为底物，通过d-甘露糖异构酶催化生成d-甘露糖。生物酶法的反应条件温和，原料果糖的成本较低廉，副产物少而且产物分离纯化容易。因此，生物酶法是制备甘露糖更佳的选择。
3.d-甘露糖异构酶是一类醛酮异构酶，可逆催化果糖生成甘露糖。1956年在嗜糖假单胞菌中首次发现d-甘露糖异构酶，随后在黄单胞杆菌也发现有该酶的存在。据报道，来自土壤杆菌放线杆菌m-1的d-甘露糖异构酶将果糖的浓度从5％增加至40％时，约有25％的果糖转化为d-半乳糖(hirose j.et al.bioscience,biotechnology,and biochemistry,2001,65(3):658-661)。2015年，江波等设计了假单胞d-甘露糖异构酶高效转化d-果糖生成d-甘露糖的生产工艺(江波等.一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法:中国,cn201510195854.4[p].2015-07-15.)。目前已经被证明可以从假单胞菌、链霉菌、大肠杆菌等菌属中分离出来相关酶基因，多以大肠杆菌为载体合成工程菌(wu h.et al.appl microbiol biotechnol.2019；103(21-22):8753-8761.)。目前已报道的甘露糖异构酶主要来源于细菌，如嗜糖假单胞菌、水田芹黄单胞菌、嗜色链霉菌、放射土壤杆菌、大肠杆菌、洋葱假单胞菌等。除洋葱假单胞菌的d-甘露糖异构酶的最适ph为弱酸性外(allenza p et al.applied biochemistry and biotechnology,1990,24/25(1):171-182)，大多数d-甘露糖异构酶在ph 7.0-8.0的围内有最高酶活。截至目前为止，已经表征的甘露糖异构酶数量有限，活性不高，在强碱性及有机溶剂(如乙醇)存在等特殊条件下催化效率较低，影响到该酶的应用范围。本发明提供一个可以在大肠杆菌中高效表达的甘露糖异构酶基因，不仅活性高﹑而且对强碱性及乙醇有较高耐受性，展现出良好的生产应用前景。


技术实现要素：

[0004]
本发明目的是提供一种耐碱耐乙醇型甘露糖异构酶及其编码基因。
[0005]
从沈阳农业大学植物园的林下取土壤，进行微生物富集培养，然后从中提取宏基
因组dna，通过简并引物pcr扩增目的大小的dna片段，经过分子克隆，异源表达，催化功能验证和dna测序等步骤，鉴定获得一种可高效转化果糖生成甘露糖的耐碱耐乙醇型甘露糖异构酶编码基因。具体的研究方案为：
[0006]
1)宏基因组dna的提取。从沈阳农业大学植物园的林下取土壤，按照1％(w/w)加入果糖，加水湿润后，在37℃培养箱中恒温培养10d，提取高质量宏基因组dna。
[0007]
2)mg-yihs基因的获得：用本实验室已有的简并引物mg-yihs-for和mg-yihs-rev，以宏基因组dna为模板，进行pcr扩增，其反应体系为：1.5μl宏基因组dna，0.5μl taq dna聚合酶，1
×
taq buffer，40mmol/l的mg-yihs-for和mg-yihs-rev引物各0.5μl，0.8μl 100mmol/l的dntp，加水到40μl。反应条件为：94℃预热3min，30个循环的94℃加热变性30s，52℃退火40s，72℃延伸反应3min，循环结束后72℃反应10min。
[0008]
3)pany2-mg-yihs重组质粒的构建：将上述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的大小的条带用胶回收试剂盒进行胶回收。用回收后的dna为模板，用简并引物mg-yihs-for和mg-yihs-rev进行二次pcr，pcr反应条件同上步。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的大小的条带用胶回收试剂盒进行胶回收。将回收后的dna产物用ndei和bamhi分别酶切，然后连接到同样经过双酶切的pany2载体上。具体的酶切反应体系为：ndei和bamhi各1.0μl、1
×
限制性酶反应buffer、16μl的pany2线性载体或胶回收纯化的pcr产物，加水至100μl，在16℃温度下反应5h。将酶切后的胶回收纯化的pcr产物或者pany2线性载体按照摩尔比1:3的比例混合，经t4 dna连接酶连接后转化大肠杆菌jm109菌株。挑取转化后平板上生长的菌落，接种到含有卡那霉素的lb培养基中，进行液体培养。
[0009]
4)活性初步筛选和dna测序分析。挑取的菌落在lb培养基中培养到对数生长期，加入0.1mmol/l的iptg诱导表达10h。离心收集菌体，用50mmol/l的磷酸缓冲液(ph 7.0)重悬菌体，超声破碎，离心取上清，为粗酶液。取30μl粗酶液，加入溶解于50mmol/l的磷酸缓冲液(ph 7.0)的10％果糖30μl，10μl1 mol/l的硫酸镁，混匀后37℃反应条件下反应2h。反应产物离心后取上清，用半胱氨酸-咔唑法测定甘露糖生成量。选择其中有活性，而且活力最强的一个菌在含有卡那霉素的培养基中液体培养，并提取质粒，进行dna测序，其读码框如seq id no:1所示，质粒的物理图谱如图1所示。经过鉴定，基因编码蛋白为甘露糖异构酶，具有高活性、耐碱性、耐乙醇等特点。具体分析方法见实施例。
[0010]
与目前已知的甘露糖异构酶相比，本发明所述基因编码的甘露糖异构酶具有如下突出的优点：
[0011]
1)本发明筛选获得的基因所编码的甘露糖异构酶的最适宜ph为7.0，但是在ph＝10.0的强碱性条件下仍然保持高达60％的相对活性。因此，该酶活性高，而且既可以在中性条件下进行催化反应，也可以在强碱性条件下催化反应，其应用范围非常广泛。
[0012]
2)本发明筛选获得的基因所编码的甘露糖异构酶的最适宜温度为40℃，但是在70℃温浴30min仍能保持20％的活性。因此，该酶既可以在常温条件下使用，也可以在60-70℃条件下催化反应。因此这一特点也增加了该酶的应用范围。
[0013]
3)本发明筛选获得的基因所编码的甘露糖异构酶具有独特的乙醇耐受性。大多数已知的酶在乙醇等有机溶剂的存在下，会发生全部或者部分变性。而该酶在10％(v/v)乙醇溶液中酶活性不仅没有降低，反而增加了10％。这说明该酶比一般的酶更适宜在含有乙醇的条件下催化反应。另外，这一特点也提示使用者可以在催化反应体系中加入一定量的乙
醇，在促进甘露糖异构酶催化效率的同时，抑制其他酶或者微生物的作用，从而达到更佳的催化效果。
附图说明
[0014]
图1本发明构建pany2-mg-yihs质粒的物理图谱。mg-yihs是高稳定性耐乙醇型甘露糖异构酶的编码基因。
[0015]
图2本发明获得的mg-yihs基因编码甘露糖异构酶的最适温度检测。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。
[0016]
图3本发明获得的mg-yihs基因编码甘露糖异构酶的热稳定性检测，每个温度处理30min后测定其相对活性。具体方法是每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。
[0017]
图4本发明获得的mg-yihs基因编码甘露糖异构酶的最适ph检测。每个ph下测定其相对活性，具体方法是每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。
[0018]
图5本发明获得的mg-yihs基因编码甘露糖异构酶的ph稳定性检测，每个ph处理30min后测定其相对活性。具体方法是每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。
[0019]
图6本发明获得的mg-yihs基因编码甘露糖异构酶在不同浓度有机溶剂存在下的相对活性。
具体实施方式
[0020]
本发明从土壤宏基因组dna中筛选获取一个能够编码甘露糖异构酶的基因，该酶的最适宜ph为7.0，但是在ph＝10.0的强碱性条件下仍然保持高达60％的相对活性；同时，该酶的最适宜温度为40℃，但是在70℃温浴30min仍能保持20％的活性。另外，该酶具有独特的乙醇耐受性。该酶在10％(v/v)乙醇溶液中酶活性不仅没有降低，反而增加了10％。这些特征使该酶在特殊环境下催化反应方面，比现有的甘露糖异构酶更具优势。
[0021]
实施例1：本发明获得的mg-yihs基因编码蛋白的表达和最适温度和温度稳定性的测定：
[0022]
将pany2-mg-yihs重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)菌株中，并接种到tb培养液中培养到对数生长期，用0.2mmol/l iptg诱导表达5h。然后用离心的方法收集菌体，用50mmol/l的磷酸缓冲液(ph＝7.0)重悬菌体，并超声破碎菌体。用离心方法收集上清液，并用ni-nta纯化柱进行重组酶的纯化。取30μl纯化的酶，加入溶解于50mmol/l的磷酸缓冲液(ph 7.0)的10％果糖30μl，10μl1mol/l的硫酸镁，混匀后37℃反应条件下反应2h。反应产物离心后取上清，用hplc对产物进行分析。采用shodex nh2p-50 4e色谱柱，rid-10a示差检测器，lc-10at液体泵，流动相为75％乙腈(v/v)，流速1ml每min，柱温为40℃。为了测定mg-yihs的最适反应温度。0.5ml酶液与3ml的含有10％果糖的50mmol/l的磷酸缓冲液(ph＝7.0)混合，反应时间为10min。在20℃到90℃的温度范围内，每隔10℃测定一个反应，反应结束后，用hplc检测产物，检测条件如上所示。每个检测取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，mg-yihs最适温度是40℃，而70℃仍能保持
40％的相对活性(如图2所示)。为了测定mg-yihs的热稳定性，在20℃到90℃的温度范围内，每隔10℃测定一个反应，在相应温度下温浴30min。温浴结束后，采用上述在最适温度40℃条件下测定残余酶活性。每个检测取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。如图3所示，残余酶活性随着温度的升高而显著下降，50℃下温浴30min，酶残留50％活性；而60℃下温浴30min，酶残留30％活性；而70℃下温浴30min，酶仍残留20％活性。因此，mg-yihs的最适使用温度应为40℃，但是该酶具有良好的热稳定性。
[0023]
实施例2：本发明获得的mg-yihs基因编码蛋白的最适ph和ph稳定性的测定：
[0024]
mg-yihs的蛋白表达，纯化，活性测定方法同上。为了检测该酶的最适ph，在ph 3.0到ph 10.0范围内，每隔1个ph测定一个反应，反应时间设定为10min。反应结束后，用hplc进行产物检测分析，检测条件同上。每个检测取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。如图4所示，mg-yihs的最适ph＝7.0，但是在ph10.0的强碱性反应液中，能够保有40％的相对活性。目前已知的甘露糖异构酶的ph范围多为中性，而本发明所获得的mg-yihs则显示出非常突出的碱耐受性。为了测定mg-yihs的ph稳定性，在ph 3.0到ph 10.0范围内，每隔1个ph测定一个反应，在相应的ph下处理30min，然后在采用上述在最适温度和最适ph条件下测定残余酶活性。每个检测取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。残余酶活性在ph＞7.0和ph＜7.0都显著下降，但是与对照相比，ph10.0的强碱性反应液中处理3min，仍然能够保有60％的相对活性(如图5所示)，进一步证明了该酶在碱性条件下突出的稳定性特征。
[0025]
实施例3：本发明获得的mg-yihs基因编码蛋白在不同有机溶剂存在下的相对活性：
[0026]
为了研究该酶在有机溶剂存在下的相对活性，将该酶与10％-50％(v/v)的甲醇、乙醇或者丙酮混合，进行催化反应，具体催化反应条件同上。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，10％的乙醇对该酶的相对活性有促进作用。一般情况下，有机溶剂的存在会引起酶的活性全部或者部分丧失，低浓度乙醇对酶活性的促进作用的机理值得深入研究。不同浓度的甲醇和丙酮，以及高浓度的乙醇都对酶活性有较强烈的抑制作用，其中甲醇的抑制作用最为明显(如图6所示)。乙醇耐受性的特点提示使用者可以在催化反应体系中加入一定量的乙醇，在促进甘露糖异构酶催化效率的同时，抑制其他酶或者微生物的作用，从而达到更佳的催化效果。