一种高通量生物样本DNA的提取试剂盒和提取方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种高通量生物样本dna的提取试剂盒和提取方法。

背景技术：

1、定植在胃肠道的细菌、古生菌以及真菌的集合被称为肠道菌群，肠道菌群在成千上万年的时间里与宿主共同进化，形成了复杂而又互利的关系。有越来越多的证据表明这些菌群与宿主的多种慢性疾病密切相关，加强肠道菌群的研究对防治、治疗和疾病预后都有重要的意义。肠道菌群研究使用最多的方法是对粪便微生物dna检测，样本量大且易获得，抽提得到的dna结合二代测序技术可以获得大量的微生物群落信息，从而反映出宿主的健康状况。

2、然而粪便样本复杂多样，通常核酸提取步骤主要包括细胞裂解、核酸纯化回收。常用的微生物dna提取方法有过柱法(中国发明专利：cn201811636712.7，公开日：20190319)、探针法(中国发明专利：cn201810942556.0，公开日：20181207)、磁珠法(中国发明专利：cn201810812474.4，公开日：20181123)等，由于适用范围受限、操作步骤较多等导致通量无法提高，难以适配自动化生产，因此有必要开发一种除杂彻底、提取得率高、操作简单且能自动化操作的粪便dna提取方案。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高通量生物样本dna的提取试剂盒。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

3、本发明的第一方面在于提供一种高通量生物样本dna的提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、溶菌酶、蛋白酶、rna酶、漂洗液a、漂洗液b、漂洗液c和洗脱液；

4、其中，裂解液包括tris-hcl、edta、nacl、sds、pvp和无菌水；

5、漂洗液a包括盐酸胍、乙醇和无菌水；

6、漂洗液b包括tris-hcl、乙醇和无菌水，其中乙醇的体积分数为b；

7、漂洗液c包括tris-hcl、乙醇和无菌水，其中乙醇的体积分数为c。

8、洗脱液包括tris-hcl和无菌水。

9、优选地，所述裂解液中tris-hcl的浓度为0.05-0.1m、edta的浓度为0.01-0.1m、nacl的浓度为0.1-0.7m、sds的浓度为1-5wt％、pvp的浓度为1-5wt％；

10、优选地，所述磁珠为硅基磁珠；所述溶菌酶的浓度为0.5-1.5mg/ml；所述蛋白酶为蛋白酶k，浓度为0.5-1mg/ml；所述rna酶为rna酶a，浓度为0.05-0.1mg/ml；

11、优选地，漂洗液a中盐酸胍的浓度为10-50wt％、乙醇的体积分数为20-60％；

12、优选地，漂洗液b中tris-hcl的浓度为0.02m-0.1m、乙醇的体积分数为70-90％；

13、优选地，漂洗液c中tris-hcl的浓度为0.02m-0.1m、乙醇的体积分数为75-85％。

14、优选地，洗脱液c中tris-hcl的浓度为0.005m-0.02m。

15、本发明的第二方面在于提供一种高通量生物样本dna的提取试剂盒的提取方法，具体步骤包括：

16、s11：生物样本采集

17、采集3-5g生物样本放入收集管中，密封后-80℃低温冷冻保存；

18、s12：裂解液制备

19、向离心管a中加入裂解液、溶菌酶、蛋白酶k和rna酶a；

20、s13：生物样本取样

21、待生物样本解冻后，使用小勺挖取生物样本转移到有裂解液的离心管a中，放到60-70℃水浴锅中孵育45分钟。

22、s14：磁珠吸附

23、将裂解后的样本转移至离心管b中，加入5μl硅基磁珠，加入300μl异丙醇，涡旋混匀后瞬离，室温静置5min。

24、将静置完成的样本置于磁力架5min，吸弃上清。

25、s15：漂洗

26、向弃完上清的离心管b中，加入700-900μl的漂洗液a，将离心管b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀5min，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。

27、向弃完上清的离心管b中，加入700-900μl的漂洗液b，将离心管b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀5min，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。

28、向弃完上清的离心管b中，加入700-900μl的漂洗液c，将离心管b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀5min，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。

29、s16：晾干

30、将离心管b在室温晾干5min。

31、s17：洗脱

32、将离心管b从磁力架上取下，加入100μl的洗脱液，吹打混匀，60-70℃振荡孵育5min。

33、将离心管b放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将dna溶液转至新的离心管c中。

34、优选地，所述生物样本选自人或小鼠等动物排出粪便样本和水体滤膜上的微生物样本中的一种。

35、优选地，所述步骤s12具体如下：向1.5ml离心管a中加入400μl裂解液再加入溶菌酶，蛋白酶k、rna酶a，并且总体积不超过450μl；其中溶菌酶至终浓度为1mg/ml、蛋白酶k至终浓度为0.8mg/ml、rna酶a至终浓度0.1mg/ml。

36、本发明的第三方面在于提供一种高通量生物样本dna的提取试剂盒的自动提取方法，具体步骤包括：

37、s1，取六块深孔板，向第一板的每个孔中灌装裂解液，标记为裂解液深孔板；向第二板的每个孔灌装硅基磁珠，标记为磁珠深孔板；向第三板的每个孔灌装漂洗液a，标记为漂洗液a深孔板；向第四板的每个孔灌装漂洗液b，标记为漂洗液b深孔板；向第五板的每个孔灌装漂洗液c，标记为漂洗液c深孔板；向第六板的每个孔灌装洗脱液，标记为洗脱液深孔板；并分别使用铝箔进行封口；

38、s2，向裂解液深孔板的每个孔中加入溶酶菌、蛋白酶k、rna酶a；待粪便样本解冻后，使用小勺挖取生物样本转移到裂解液深孔板的对应孔位中；

39、s3，将裂解液深孔板放到自动化提取仪的1号板位，磁珠深孔板放到自动化提取仪的2号板位，漂洗液a深孔板放到自动化提取仪的3号板位，漂洗液b深孔板放到自动化提取仪的4号板位，漂洗液c深孔板放到自动化提取仪的5号板位，洗脱液深孔板放到自动化提取仪的6号板位；

40、s4，运行程序，其中程序设定如下：

41、1,1号板位65℃加热裂解45分钟；

42、2，暂停程序，取出裂解液深孔板，每个孔中加入300μl异丙醇，放回仪器中；

43、3，磁棒到2号板位吸附磁珠，然后转移到1号板位，震荡混匀磁珠和裂解液；

44、4，磁棒到2号板位吸附磁珠到3号板位，震荡混匀磁珠和漂洗液1，等待5min；

45、5，磁棒到3号板位吸附磁珠到4号板位，震荡混匀磁珠和漂洗液2，等待5min；

46、6，磁棒到4号板位吸附磁珠到5号板位，震荡混匀磁珠和漂洗液3，等待5min；

47、7，磁棒到5号板位吸附磁珠到6号板位，震荡混匀磁珠和洗脱液，等待5min；

48、8，磁棒到6号板位吸附磁珠到2号板位；

49、9，运行结束；此时提取的dna在6号洗脱液深孔板中。

50、优选地，所述步骤s1中，裂解液深孔板的每个孔中灌装400μl裂解液；磁珠深孔板的每个孔中灌装5μl硅基磁珠；漂洗液a深孔板的每个孔中灌装800μl漂洗液a；漂洗液b深孔板的每个孔中灌装800μl漂洗液b；漂洗液c深孔板的每个孔中灌装800μl漂洗液c；洗脱液深孔板的每个孔中灌装100μl洗脱液；

51、优选地，所述步骤s2中，裂解液深孔板的每个孔中溶酶菌的浓度为1mg/ml、蛋白酶k的浓度为0.8mg/ml、rna酶a的浓度为0.1mg/ml。

52、本发明的第四方面在于提供本发明第一方面所述的一种高通量生物样本dna的提取试剂盒在粪便样本或水体滤膜微生物中dna提取的应用。

53、本发明的有益效果

54、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

55、本发明试剂配方简单、实验操作方便、适用多种动物和人的粪便样本、且能很好地匹配各种自动化核酸提取仪，得到的dna率稳定，是搭配ngs做肠道微生物菌群检测的良好选择。