一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法与流程

一种用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法
技术领域
1.本发明涉及外科手术恢复技术领域，具体为一种用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法。


背景技术：

2.青光眼是以视网膜神经节细胞丢失为特征的多因素视神经退行性病变，是血管、遗传、解剖和免疫等多因素的组合，继白内障后第二个导致失明的主要原因，而且这种失明通常是不可逆的，严重影响个人的健康和生活质量，同时还会给患者和社会带来巨大的情感、医疗和经济负担，目前对青光眼的诊断主要依靠病史、形态学和功能学的检查，然而一些患者对早期视觉功能的变化并不敏感，从而导致了诊断的滞后，一旦患者诉视力下降，此时视功能损害将近超过50％，再进行抗青光眼治疗，往往达不到理想效果，目前，青光眼相关的组织或体液生化指标以及检测标准仍处于空白状态，因此，寻找一种特异性高、灵敏度高、个性化的生物标志物对青光眼诊断和检测尤为重要；
3.迄今为止，降低眼压仍是青光眼唯一可用的治疗途径，在药物不能充分降眼压的情况下，外科手术可实现这一目的，常用手术包括小梁切除术、深层巩膜切除术、引流装置植入术等，旨在另开旁路将房水从前房排入不同的流出区域，特别是结膜下tenon’s囊和或通过脉络膜上腔作为流出区域以降低眼压，然而，新创建的引流通道失效或植入物阻塞，往往是由于手术切口处炎症反应和无法控制的瘢痕形成造成的，并导致眼压再次增加，国内外专家致力于研究抗瘢痕化药物，其中抗代谢药物、激素、抗血管内皮生长因子、免疫抑制剂等的应用效果取得一致认可，但这些药物对组织选择的特异性低，往往因浓度或作用时间的不灵活对不同个体眼部组织造成损害，如角膜毒性、滤过泡渗漏、低眼压性黄斑病变、滤过泡或引流物相关性眼部感染等，因此寻找具有个性化、特异性高并且更安全的抗瘢痕药物有着非常重要的临床意义；
4.长链非编码rna(long non-coding rnas，lncrnas)是长于200个核苷酸的具有很少或没有编码潜能的rna转录物，具有高度保守性和组织特异性，参与胚胎干细胞的多能性，细胞周期调控，癌症的发展以及其他疾病的发病过程，lncrna可响应各种刺激的信号，募集相应的复合物以激活或沉默基因表达，不仅参与tenon’s成纤维细胞的表型分化，对青光眼术后切口局部炎症环境、干细胞的维持也存在重要的调节作用，近3年来，我们开展了对青光眼患者以及正常对照组tenon’s囊纤维组织的基因芯片测序，获得了具有差异表达的ncrna以及mrna数据库，阐明了lncrna nr_003923作为cerna通过竞争性结合mir-760/mir-215-3p调控il-22ra1参与青光眼术后滤过道纤维化发病的机制，并发表sci期刊论文1篇(cell death&disease)，但要将结果应用于临床，仍需对lncrna nr_003923的在人体内的检测方法进行深入探讨；
5.为避免青光眼患者失明可能，我们需要对青光眼的发病做到早期诊断、早期治疗以及术后预防瘢痕形成，lncrna nr_003923在青光眼患者中高度表达，并且调节术后瘢痕
化过程，具有成为检测青光眼发病指标(青光眼相关生物标志物)以及监测瘢痕化程度指标的巨大潜力，眼球的解剖特征以及体液-血液流动的动态平衡，使得眼球组织取样这一环节在研究疾病诊疗手段中，显得格外重要，青光眼发病后，患者眼内压升高，刺激眼球各部分细胞内rna表达改变，改变的rna以cfrna形式释放，进入血液循环、体液循环，通过检测cfrna，早期诊断青光眼以及检测术后瘢痕化程度。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法，以解决背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法，包括以下步骤：
8.步骤一：根据lncrnanr_003923序列(ncbi登录号)和18s基因序列(ncbi登录号)分别设计特异性引物，设计规则为：引物长度不超过25bp，tm值50℃-70℃，gc含量40-50％，扩增产物长度110bp，设计序列为：
9.lncrnanr_003923上游引物序列：agatgcagacgctcctgatg
10.lncrnanr_003923下游引物序列：aacacagaaaccagacggca
11.内参基因18s上游引物序列：cagccacccgagattgagca
12.内参基因18s下游引物序列：tagtagcgacgggcggtgtg
13.步骤二：差异表达lncrna检测，使用trizol试剂(invitrogenlifetechnologies)从临床组织中提取总rna，使用arraystarrnaflashlabelingkit(arraystar，rockville)对样本进行标记，使用agilentsurehyb进行杂交实验，然后洗涤芯片，洗涤后的芯片使用agilentdnamicroarrayscanner进行扫描，应用agilentfeatureextractionv11.0.1.1软件采集芯片探针信号值，使用agilentgenespringgxv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(foldchange，fc)筛选出所有差异表达的lncrnas和mrnas，筛选标准为倍数变化》1.5，p《0.05；
14.步骤三：对差异表达基因进行基因本体论(geneontology，go)分析，描述差异表达基因的功能属性，通过kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)分析，描述差异表达基因的生物学途径，筛选出5条上调lncrna，分别为：lncrnanr_003923、nr_051983、nr_103749、nr_024358、nr_046113，4条下调lncrna，分别为：enst00000553396、tcons_00004501、nr_028344、nr_024049，通过构建编码基因和非编码基因的共表达网络，根据筛选出的差异表达lncrnas，应用预测数据库mircode匹配出与其相互作用的mirna，应用mirna靶基因预测数据库(mirdb、mirtarbase和targetscan)，筛选出相应的mrna，最终通过分子生物学方法，确定lncrnanr_003923可以调节筋膜组织瘢痕化；
15.步骤四：样本收集情况(分组)
16.健康对照人群30例，青光眼患者30例，抗青光眼术后高眼压患者35例，抗青光眼术后眼压控制正常患者30例。收集血液样本2ml。
17.a.健康对照人群
18.a.年龄18-75岁；
19.b.无青光眼等眼科疾病病史
20.c.无慢性疾病史、短期或长期未服用激素治疗。
21.b.青光眼患者入组标准：
22.a.年龄18-75岁；
23.b.眼内压(iop)升高》21mmhg；
24.c.角镜检查:前房角开放，或周边部虹膜与小梁面夹角减小，房角变窄或关闭；
25.d.激发试验—暗室及暗室俯卧试验可以呈阳性；
26.e.眼底及视野典型青光眼性改变；
27.d.特征性视盘形态改变和视野缺损
28.杯、盘比增大；视乳头神经盘沿变窄；盘沿凹陷或切迹；越过视盘边缘的神经纤维层出血(即drance出血或线状出血)；视杯纵向延伸扩大；视网膜血管离开视乳头时屈膝成角等。
29.c.抗青光眼术后高眼压患者入组标准：
30.a.已行青光眼手术患者
31.b.年龄18-75岁；
32.c.眼内压(iop)升高》21mmhg；
33.d.裂隙灯检查：滤过道明显瘢痕化
34.d.抗青光眼术后眼压控制正常患者入组标准：
35.a.已行青光眼手术患者
36.b.年龄18-75岁；
37.c.眼内压(iop)《16mmhg；
38.d.裂隙灯检查：滤过泡功能正常，形态隆起。
39.步骤五：使用takara公司血清cfran提取试剂盒提取cfrna；使用promega公司rt-pcr试剂盒,产品货号为m5108,根据说明书进行，取2ul上述rna提取液，70℃反应10min，在反应管加入以下组分：
40.10x逆转录酶缓冲液，
41.10mmol/ldntp，
42.rna酶抑制剂，
43.oligo(dt)，
44.amv逆转录酶，
45.无rnase去离子水，
46.total体积20ul，votex混匀，瞬时离心，pcr仪42℃反应15min，进行cdna第一链合成，反应结束，95℃反应5min以灭活逆转录酶；
47.步骤五：配置以下反应体系：
48.10x荧光定量pcr缓冲液
49.低rox溶液，
50.上游引物，
51.下游引物，
52.dntp，
53.taqdna聚合酶，
54.cdna，
55.去离子水补充至总体积20ul，
56.pcr条件为在95℃预变性3分钟，然后95℃变性30秒、52℃退火40秒，共38个循环(pcr条件可根据使用的荧光定量pcr仪略做调整)，在每个循环结束时进行荧光检测。
57.步骤六：数据分析和结果判读
58.通过内参基因18s对lncrna数据进行标准化，并使用2-δδct
方法进行数据分析。
59.作为本发明的一种优选技术方案，所述pcr条件为：95℃预变性3分钟，然后95℃变性30秒、52℃退火40秒，共38个循环(pcr条件可根据使用的荧光定量pcr仪略做调整)，在每个循环结束时进行荧光检测。
60.作为本发明的一种优选技术方案，所述total体积20ul，votex混匀，瞬时离心，pcr仪42℃反应15min，进行cdna第一链合成，反应结束，95℃反应5min以灭活逆转录酶。
61.作为本发明的一种优选技术方案，数据分析和结果判读通过内参基因18s对lncrna数据进行标准化，并使用2-δδct
方法进行数据分析。
62.作为本发明的一种优选技术方案，检测样本为青光眼术后患者，特征：由于术后滤过道瘢痕化，导致手术失败，患者眼压再次升高，严重影响患者视觉质量，最终导致失明。样本类型为：血清，属于无创检测。
63.本发明具备以下有益效果：
64.该用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法，对于本技术而言，发明人发现lncrna nr_003923在青光眼患者中相对于照组人群而言，表达量显著上调，并且在不良预后和术后瘢痕化严重的患者中表达量持续增高，在术后良好，切瘢痕化降低的患者中表达量下降，提示lncrna nr_003923可以作为潜在青光眼早期诊断和预后评价的的生物学标志物，基于此发现，本发明的试剂盒能够快速、准确、定量lncrna nr_003923的表达量水平，有效杜绝了常规荧光定量pcr重复性低、准确性低的缺陷，为青光眼的早期诊断和预后评价提供了重要的检测方法。
附图说明
65.图1为本发明对照人群、青光眼患者、抗青光眼术后高眼压组者、抗青光眼术后眼压控制正常患者对比血浆lncrna nr_003923基因差异表达散点示意图；
66.图2为本发明lncrna nr_003923的roc曲线图；
67.图3为本发明lncrna nr_003923与青光眼患者眼压(iop)相关性分析图。
具体实施方式
68.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
69.本实施方案中：一种用于青光眼患者手术后血清lncrna检测的引物与应用方法，包括以下步骤：
70.步骤一：根据lncrnanr_003923序列(ncbi登录号)和18s基因序列(ncbi登录号)分
别设计特异性引物，设计规则为：引物长度不超过25bp，tm值50℃-70℃，gc含量40-50％，扩增产物长度110bp，设计序列为：
71.lncrnanr_003923上游引物序列：agatgcagacgctcctgatg
72.lncrnanr_003923下游引物序列：aacacagaaaccagacggca
73.内参基因18s上游引物序列：cagccacccgagattgagca
74.内参基因18s下游引物序列：tagtagcgacgggcggtgtg
75.步骤二：差异表达lncrna检测，使用trizol试剂(invitrogenlifetechnologies)从临床组织中提取总rna，使用arraystarrnaflashlabelingkit(arraystar，rockville)对样本进行标记，使用agilentsurehyb进行杂交实验，然后洗涤芯片，洗涤后的芯片使用agilentdnamicroarrayscanner进行扫描，应用agilentfeatureextractionv11.0.1.1软件采集芯片探针信号值，使用agilentgenespringgxv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(foldchange，fc)筛选出所有差异表达的lncrnas和mrnas，筛选标准为倍数变化》1.5，p《0.05；
76.步骤三：对差异表达基因进行基因本体论(geneontology，go)分析，描述差异表达基因的功能属性，通过kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)分析，描述差异表达基因的生物学途径，筛选出5条上调lncrna，分别为：lncrnanr_003923、nr_051983、nr_103749、nr_024358、nr_046113，4条下调lncrna，分别为：enst00000553396、tcons_00004501、nr_028344、nr_024049，通过构建编码基因和非编码基因的共表达网络，根据筛选出的差异表达lncrnas，应用预测数据库mircode匹配出与其相互作用的mirna，应用mirna靶基因预测数据库(mirdb、mirtarbase和targetscan)，筛选出相应的mrna，最终通过分子生物学方法，确定lncrnanr_003923可以调节筋膜组织瘢痕化；
77.步骤四：样本收集情况(分组)
78.健康对照人群30例，青光眼患者30例，抗青光眼术后高眼压患者35例，抗青光眼术后眼压控制正常患者30例。收集血液样本2ml。
79.a.健康对照人群
80.a.年龄18-75岁；
81.b.无青光眼等眼科疾病病史
82.c.无慢性疾病史、短期或长期未服用激素治疗。
83.b.青光眼患者入组标准：
84.a.年龄18-75岁；
85.b.眼内压(iop)升高》21mmhg；
86.c.角镜检查:前房角开放，或周边部虹膜与小梁面夹角减小，房角变窄或关闭；
87.d.激发试验—暗室及暗室俯卧试验可以呈阳性；
88.e.眼底及视野典型青光眼性改变；
89.d.特征性视盘形态改变和视野缺损
90.杯、盘比增大；视乳头神经盘沿变窄；盘沿凹陷或切迹；越过视盘边缘的神经纤维层出血(即drance出血或线状出血)；视杯纵向延伸扩大；视网膜血管离开视乳头时屈膝成角等。
91.c.抗青光眼术后高眼压患者入组标准：
92.a.已行青光眼手术患者
93.b.年龄18-75岁；
94.c.眼内压(iop)升高》21mmhg；
95.d.裂隙灯检查：滤过道明显瘢痕化
96.d.抗青光眼术后眼压控制正常患者入组标准：
97.a.已行青光眼手术患者
98.b.年龄18-75岁；
99.c.眼内压(iop)《16mmhg；
100.d.裂隙灯检查：滤过泡功能正常，形态隆起。
101.步骤五：使用takara公司血清cfran提取试剂盒提取cfrna；使用promega公司rt-pcr试剂盒,产品货号为m5108,根据说明书进行，取2ul上述rna提取液，70℃反应10min，在反应管加入以下组分：
102.10x逆转录酶缓冲液，
103.10mmol/ldntp，
104.rna酶抑制剂，
105.oligo(dt)，
106.amv逆转录酶，
107.无rnase去离子水，
108.total体积20ul，votex混匀，瞬时离心，pcr仪42℃反应15min，进行cdna第一链合成，反应结束，95℃反应5min以灭活逆转录酶；
109.步骤五：配置以下反应体系：
110.10x荧光定量pcr缓冲液
111.低rox溶液，
112.上游引物，
113.下游引物，
114.dntp，
115.taqdna聚合酶，
116.cdna，
117.去离子水补充至总体积20ul，
118.pcr条件为在95℃预变性3分钟，然后95℃变性30秒、52℃退火40秒，共38个循环(pcr条件可根据使用的荧光定量pcr仪略做调整)，在每个循环结束时进行荧光检测。
119.步骤六：数据分析和结果判读
120.通过内参基因18s对lncrna数据进行标准化，并使用2-δδct
方法进行数据分析。。
121.本实施例中，pcr条件为：95℃预变性3分钟，然后95℃变性30秒、52℃退火40秒，共38个循环(pcr条件可根据使用的荧光定量pcr仪略做调整)，在每个循环结束时进行荧光检测；total体积20ul，votex混匀，瞬时离心，pcr仪42℃反应15min，进行cdna第一链合成，反应结束，95℃反应5min以灭活逆转录酶；数据分析和结果判读通过内参基因18s对lncrna数据进行标准化，并使用2-δδct
方法进行数据分析；检测样本为青光眼术后患者，特征：由于术后滤过道瘢痕化，导致手术失败，患者眼压再次升高，严重影响患者视觉质量，最终导致失
明。样本类型为：血清，属于无创检测。
122.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。