一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.硫酸软骨素是一类酸性糖胺聚糖类大分子粘多糖，多以蛋白聚糖侧链的形式广泛存在于动物结缔组织中，特别是软骨、皮肤、血管、韧带和肌腱中。其结构如图1所示，β-1,3糖苷键交替连接葡糖醛酸(glca)和n-乙酰半乳糖胺(galnac)以形成重复二糖单元，二糖单元间通过β-1,4糖苷键连接组成硫酸软骨素及软骨素的碳链骨架，一般二糖单元有20～100个。硫酸软骨素是经软骨素硫酸化后得到的，软骨素按其硫酸化位置可划分为多种类型。硫酸软骨素a(cs a)、硫酸软骨素c(cs c)分别在c-4位、c-6位羟基上进行硫酸化；硫酸软骨素e在galnac的c-4位和c-6位的羟基都会硫酸化；硫酸软骨素b(cs b)的结构是硫酸软骨素a中glca的c-5异构化为l-艾杜糖醛酸(idoa)。其中，动物来源的硫酸软骨素多为cs a和cs c。
3.硫酸软骨素在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用。在欧美、日本等国家，硫酸软骨素被广泛用于防治心脑血管疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎等。硫酸软骨素常与氨基葡萄糖配合使用，可以刺激软骨细胞的增殖以及pgs、ⅱ型胶原、透明质酸的生物合成，从而缓解骨关节炎患者疼痛、减少关节肿胀和积液，对改善关节功能、治疗骨关节炎具有较好的疗效。硫酸软骨素还有其他多种药理活性，如抗病毒感染、保护黏膜、促进细胞代谢、加速伤口愈合等。硫酸软骨素除了具有多种药理活性，还可以作为保健品、食品中的添加剂，在食品加工、化妆品、临床医学等领域具有广泛的应用开发前景。
4.商业化硫酸软骨素主要以鲨鱼软骨、气管、鼻中隔等为来源，采用碱法、酶法等提取方法进行工业化生产。提取、除蛋白、酶解、沉淀干燥等是浓碱法提取硫酸软骨素的主要步骤，而酶法提取则经过酶解、活性炭吸附、醇沉、除杂等流程。目前我国在硫酸软骨素的生产中仍面临结构不均匀、原材料不稳定、容易受到动物源致病微生物及硫酸角质素污染等问题，已经难以满足现代规模化高质量生产硫酸软骨素的需求。此外，现在大多数研究都是利用大肠杆菌k4(e.coli k4)发酵制备软骨素，由于软骨素结构类似物在大肠杆菌k4(e.coli k4)的细胞表面以荚膜多糖的形式存在，因此可以通过发酵培养获得软骨素结构类似物，然后通过对发酵所得软骨素进行硫酸化修饰，进而制备硫酸软骨素。大肠杆菌k4(e.coli k4)荚膜多糖属于group 2类，其荚膜多糖合成基因簇包括region 1、region 2、region 3这3个主要功能区，3个功能区共同完成多糖链合成及运输。region 2包含7个基因(kfoabcdefg)，直接参与血清型特异性多糖的合成，并编码负责udp糖前体生物合成最后步骤的酶，以及聚合物的组装和果糖基化。kfoa基因编码udp-葡萄糖差向异构酶，能够将udp-glcnac异构为udp-gal nac；kfoc基因编码软骨素合成酶，通过与前体udp-葡萄糖醛酸和udp-n-乙酰半乳糖胺结合并运送至多糖链的非还原末端，重复此过程使多糖链不断延伸，形成软骨素碳链骨架。但是，大肠杆菌k4(e.coli k4)中分离出的k4荚膜多糖，其软骨素碳
链骨架的葡萄糖醛酸残基c-3位连有一个果糖分支，如果以k4荚膜多糖为软骨素碳链骨架合成硫酸软骨素，需去除果糖分支，会导致碳链骨架结构完整性受到破坏，并使软骨素产量严重下降。而且，大肠杆菌k4是致病菌，分泌的毒性因子容易造成产品污染，而去除这些毒性因子将极大增加纯化成本。
5.因此，建立一种行之有效、安全的方法来生产非动物组织来源的、结构单一稳定的软骨素(可随后被硫酸化以产生硫酸软骨素)是十分有必要的。


技术实现要素：

6.1.要解决的问题
7.本发明针对现有技术中大肠杆菌k4(e.coli k4)生产软骨素中存在的问题，提供了一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，该工程益生菌以益生菌大肠杆菌nissle 1917(e.coli nissle 1917，ecn)为出发菌株，将软骨素合成酶基因(kfoc)和udp-葡萄糖胺异构酶基因(kfoa)转入至e.coli nissle 1917，并敲除e.coli nissle 1917的kfia基因和kfic基因而获得的，该工程益生菌实现了软骨素多糖的合成与分泌，可将其用于发酵生产软骨素，本发明进一步采用分批补料发酵的方式，使软骨素多糖的产量提高了30倍，为后续软骨素多糖的大规模纯化与硫酸化修饰奠定了基础。
8.2.技术方案
9.为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
10.本发明提供了一种生产软骨素的工程益生菌，该工程益生菌是将软骨素合成酶基因(kfoc)和udp-葡萄糖胺异构酶基因(kfoa)转入至e.coli nissle 1917，并敲除e.coli nissle 1917的kfia基因和kfic基因而获得的，kfia和kfic分别编码glcua转移酶和glcnac转移酶，e.coli nissle 1917在kfia和kfic两基因的共同参与下能够合成其他多糖，不利于软骨素的产生，为了避免干扰，需敲除e.coli nissle 1917的kfia基因和kfic基因。
11.优选地，上述软骨素合成酶基因(kfoc)和udp-葡萄糖胺异构酶基因(kfoa)来自大肠杆菌k4(e.coli k4)。
12.优选地，上述软骨素合成酶基因(kfoc)的基因序列如seq id no.1所示。
13.优选地，上述udp-葡萄糖胺异构酶基因(kfoa)如seq id no.2所示。
14.优选地，上述kfoa、kfoc的转入和kfia、kfic的敲除，是kfoa基因插入kfia基因片段、kfoc基因插入kfic基因片段中，通过插入，既将kfoa、kfoc的转入，同时可以将kfia、kfic敲除。
15.本发明还提供了一种上述生产软骨素的工程益生菌的构建方法，该方法以ecn为出发菌株，以kfoa基因插入kfia基因片段中的方式将kfoa基因转入ecn并敲ecn的kfia基因，获得kfia基因被kfoa基因取代的益生菌ecn-a(ecn/δkfia::kfoa)；再以ecn-a为出发菌株，以kfoc基因插入kfic基因片段中的方式将kfoc基因转入ecn-a并敲ecn-a的kfic基因，获得kfia基因被kfoa基因取代、kfic基因被kfoc基因取代的益生菌ecn-ac。
16.优选地，上述一种上述生产软骨素的工程益生菌的构建方法包括如下步骤：
17.s1：从ecn基因组上利用上游同源重组臂引物和下游同源重组臂引物分别扩增kfia基因的上、下游同源重组手臂，从e.coli k4基因组上利用引物扩增kfoa基因；
18.s2：将s1中的kfia基因上、下游同源重组手臂与kfoa基因通过融合pcr技术连接，
得到完整打靶片段δkfia::kfoa，即上游同源手臂-kfoa-下游同源手臂；
19.s3：将片段δkfia::kfoa克隆入自杀质粒pcvd442gm，pcvd442gm质粒为pcvd442质粒的衍生质粒，含庆大霉素抗性基因，获得打靶质粒pcvd442gm-δkfia::kfoa；用电转化将pcvd442gm-δkfia::kfoa转入大肠杆菌e.coliβ2155，获得供体菌e.coliβ2155/pcvd442gm-δkfia::kfoa；将供体菌与大肠杆菌ecn受体菌进行接合实验；在庆大霉素平板上筛选获得抗性的大肠杆菌克隆，其基因组整合有打靶质粒，称为ecn/pcvd442gm-δkfia::kfoa；取数个ecn/pcvd442gm-δkfia::kfoa克隆菌液铺在含10％蔗糖的lb平板上，培养至单克隆形成，通过pcr技术筛选获得kfia基因被kfoa抗性基因取代的克隆，命名为ecn-a(ecn/δkfia::kfoa)，本发明通过接合转移，将片段δkfia::kfoa整合至染色体上，使其和染色体一起复制，解决了质粒不能复制而导致目标片段被移除的问题；
20.s4：从ecn基因组上利用上游同源重组臂引物和下游同源重组臂引物分别扩增kfic基因的上、下游同源重组手臂，从e.coli k4基因组上利用引物扩增kfoc基因；
21.s5：将kfic基因上、下游同源重组手臂与kfoc基因通过融合pcr技术连接，得到完整打靶片段δkfic::kfoc，即上游同源手臂-kfoc-下游同源手臂；
22.s6：将δkfic::kfoc克隆入自杀质粒pcvd442gm，获得打靶质粒pcvd442gm-δkfic::kfoc；用电转化将pcvd442gm-δkfic::kfoc转入大肠杆菌e.coliβ2155，获得供体菌β2155/pcvd442gm-δkfic::kfoc；β2155/pcvd442gm-δkfic::kfoc供体菌与ecn/δkfia::kfoa受体菌进行接合实验，在庆大霉素平板上筛选获得抗性的大肠杆菌克隆，其基因组整合有打靶质粒，称为ecn/δkfia::kfoa/pcvd442gm-δkfic::kfoc；取数个ecn/δkfia::kfoa/pcvd442gm-δkfic::kfoc克隆菌液铺在含10％蔗糖的lb平板上，培养至单克隆形成，通过pcr技术筛选获得kfic基因被kfoc抗性基因取代的克隆，命名为ecn-ac。
23.优选地，上述s1中扩增kfia基因的上游同源重组臂引物序列为：
24.kfia-5fp:gttctctgaataactagactagct(5’磷酸化引物)，
25.kfia-5r:ggggtaatattttaattaatattgcatg。
26.优选地，上述s1中扩增kfia基因的下游同源重组臂引物序列为：
27.kfia-3f:aaacttacttttttattcacattcctg，
28.kfia-3rp:gattgttcatcattagttcaagaac(5’磷酸化引物)。
29.优选地，上述s1中扩增kfoa基因的引物序列为：
30.kfoa-f：catgcaatattaattaaaatattaccccatgaatatattagttacaggtggagcag，
31.kfoa-r：caggaatgtgaataaaaaagtaagtttttaaatataaccatttgggtttttcatttgc。
32.优选地，上述s3和/或s6中还包括通过电转化方法将打靶质粒pcvd442gm-δkfia::kfoa转入大肠杆菌dh5αλpir，富集质粒，dh5αλpir菌株来源于dh5α，在dh5α大肠杆菌基因组中引入lampir，即为dh5αλpir，该菌株可以表达pir蛋白，使得含有r6kg ori复制子的质粒可以在其中正常复制。
33.优选地，上述s3中pcr技术筛选获得kfia基因被kfoa抗性基因取代的克隆的引物序列为：
34.内部鉴定引物：
35.kfia-inf:gattcatggctgtatatacatagatgc；
36.kfia-inr:ctaacatcgacgaatcgttgag；
37.和/或外侧鉴定引物：
38.kfia-outf:gtgacataagaaattatgttgctgtggc；
39.kfia-outr:ttagggtgatcatatatcatgatgaattttatgc。
40.优选地，上述s4中扩增kfic基因的上游同源重组臂引物序列为：
41.kfic-5fp:caaaagaagagtttgatgatatcaca(5’磷酸化引物)；
42.kfic-5r:acattcacttaatgataaataaaatgagaat。
43.优选地，上述s4中扩增kfic基因的下游同源重组臂引物序列为：
44.kfic-3f:tttgttattctatatatattaaatttttggggc；
45.kfic-3rp:taactatccaattcattaaaaaatgcaac(5’磷酸化引物)。
46.优选地，上述s4中扩增kfoc基因的引物序列为：
47.kfoc-f:attctcattttatttatcattaagtgaatgtatgagtattcttaatcaagcaataaatttatataaa；
48.kfoc-r:gccccaaaaatttaatatatatagaataacaaattataaatcattctctattttttcccagg。
49.优选地，上述s6中pcr技术筛选获得kfic基因被kfoc抗性基因取代的克隆的引物序列为：
50.外侧鉴定引物：
51.kfic-outf:catagggcttgctagcggattcctg；
52.kfic-outr:caccgtcaataatctgacgcgtattcagac；
53.和/或内部鉴定引物：
54.kfic-inf:gataatcaagccgatgcagggtatg；
55.kfic-inr:cgatgaacaatcatcgcacacgag。
56.本发明还提供了一种上述生产软骨素的益生菌的应用，用于发酵生产软骨素。
57.优选地，上述应用采用分批补料发酵的方式发酵生产软骨素。
58.优选地，上述发酵生产软骨素的培养基为m9c培养基，其组分为1.36g/l无水磷酸氢二钠，0.6g/l磷酸二氢钾，0.1g/l氯化钠，0.2g/l氯化铵,2mm硫酸镁,0.1mm氯化钙,0.4％葡萄糖，0.4％络蛋白氨基酸。
59.3.有益效果
60.本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
61.(1)本发明提供的一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，运用基因工程方法，把软骨素碳链骨架的关键合成基因kfoa与kfoc导入了ecn，同时敲除干扰软骨素合成的kfia基因和kfic基因，构建了合成软骨素的工程菌株ecn-ac。经过酶法分析，发现该工程菌株ecn-ac能够合成软骨素；而且ecn是一种革兰氏阴性益生菌，血清型为o6:k5:h1，其特殊的脂多糖结构使ecn具有免疫调节功能，刺激宿主产生免疫反应，且不会产生与病原性大肠杆菌相关的任何肠毒素或细胞毒素相对大肠杆菌k4具有较高的安全性；把工程菌株ecn-ac用作食品中的添加剂，在给受体补充软骨素的同时，该益生菌的抗菌特性将给予受体更多的防护，促进受体维持更健康的肠道微生态环境。
62.(2)本发明提供的一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，通过将kfoa基因插入kfia基因片段、kfoc基因插入kfic基因片段中的方式同时实现了kfoa、kfoc
的转入和kfia、kfic敲除。引入供体菌通过接合转移，将目标片段整合至目标菌的染色体上，使其和染色体一起复制，解决了质粒不能复制而导致目标片段被移除的问题。
63.(3)本发明提供的一种生产软骨素的工程益生菌及其构建方法和应用，将其用于发酵生产软骨素，通过分批补料发酵的方式，使软骨素多糖的产量提高了30倍，为后续软骨素多糖的大规模纯化与硫酸化修饰奠定了基础。
附图说明
64.图1是软骨素的结构。
65.图2是工程菌株ecn-a的构建的验证，其中：a是kfia基因内部引物进行菌落pcr检测结果，m:dna分子量标准，从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；1-22：第1-22号克隆的内部引物扩增结果；23：ecn菌株的内部引物扩增结果(189bp)；24：阴性对照扩增结果；b是kfia基因外侧引物pcr检测结果。m:dna分子量标准，从上到下分子量依次为：10000、8000、6000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、250bp；1:第1号克隆用kfia基因外侧引物扩增的结果(2652bp)。
66.图3是工程菌株ecn-ac的构建，其中a是kfic基因内部引物进行菌落pcr检测结果，m:dna分子量标准，从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；1-14：第1-14号克隆的内部引物扩增结果；15：ecn-a菌株的内部引物扩增结果，产物长度378bp；16：阴性对照扩增结果；b是kfic基因外侧引物pcr检测结果，m:dna分子量标准。从上到下分子量依次为：10000、8000、6000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、250bp；1:第1号克隆用kfic基因外侧引物扩增的结果(3726bp)。
67.图4是ecn-ac菌落的pcr验证，其中泳道1：marker；泳道2：ecn野生株；泳道3：ecn-ac菌株；泳道4：ecn野生株；泳道5：ecn-ac菌株。
68.图5是菌株ecn-ac的摇床培养上清中软骨素浓度测定，其中cs:硫酸软骨素标准品；ecnδkfia::kan：阴性对照；k4δkfoe：阳性对照；ecn-ac：目标菌株的胞外多糖产量测定。
69.图6.菌株ecn-ac的分批补料发酵上清中软骨素浓度测定，其中cs:硫酸软骨素标准品；control：阴性对照；ecn-ac：目标菌株的发酵液胞外多糖产量测定。
具体实施方式
70.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
71.需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
72.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
73.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
74.如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精
确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
75.如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“a、b和c中的至少一个”明确包括仅a、仅b、仅c以及它们各自的组合。
76.浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
77.实施例1
78.本实施例提供工程菌株ecn-ac的构建，具体包括如下步骤：
79.s1：工程菌株ecn-a的构建
80.s11：用超保真dna聚合酶(购于生工生物公司)从ecn(购于dsmz)基因组上利用上游同源重组臂引物kfia-5fp、kfia-5r和下游同源重组臂引物kfia-3f、kfia-3rp扩增kfia基因的上、下游同源重组手臂；从e.coli k4(购于dsmz)基因组上利用引物kfoa-f、kfoa-r扩增kfoa基因；
81.s12：将kfia基因上、下游同源重组手臂与kfoa基因通过融合pcr技术连接，得到完整打靶片段δkfia::kfoa(上游同源手臂-kfoa-下游同源手臂)，融合pcr的反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s；54℃，30s；72℃，3min；20个循环；72℃，7min；融合pcr的反应体系如下：
[0082][0083][0084]
s13：将δkfia::kfoa克隆入自杀质粒pcvd442gm(pcvd442质粒的衍生质粒，含庆大霉素抗性基因)，获得打靶质粒pcvd442gm-δkfia::kfoa，具体包括：
[0085]
s131：限制性内切酶酶切反应：pcvd442gm质粒经smai酶切并去磷酸化处理后，割胶纯化，具体包括配置如下反应体系，30℃反应2h，加入3μl去磷酸化酶fastap(mbi,1u/μl)，37℃反应30min，反应结束后，载体和融合pcr产物分别经1％琼脂糖电泳分离，柱离心纯化，洗脱于50μl去离子水；
[0086]
pcvd442gm(～100ng/μl)10μl10
×
tango buffer(mbi)5μlsmai(10u/μl,mbi)2μlddh2o33μltotal50μl
[0087]
s132：连接和转化：配置如下反应体系，16℃反应过夜，δkfia::kfoa则克隆入自杀质粒pcvd442gm中，连接后，δkfia::kfoa就克隆入自杀质粒pcvd442gm中，连接产物经异丙醇沉淀后，70％乙醇洗涤，溶解于5μl去离子水。
[0088]
pcvd442gm/smai/fastap(～50ng/μl)2μlkfoa打靶片段(～50ng/μl)6μl10
×
t4 buffer1μlt4 dna ligase(5u/μl,mbi)1μltotal10μl
[0089]
s14：用电转化将pcvd442gm-δkfia::kfoa转入大肠杆菌e.coliβ2155(生工生物公司提供)，获得供体菌β2155/pcvd442gm-δkfia::kfoa，具体包括：将电感细胞e.coliβ2155及连接产物pcvd442gm-δkfia::kfoa冰置10min后，取5μl质粒加入电感细胞，继续冰置2min后，转入电击杯，电击。
[0090]
s15：β2155/pcvd442gm-δkfia::kfoa供体菌与大肠杆菌受体菌进行接合实验，将质粒pcvd442gm-δkfia::kfoa转入受体菌，具体包括：
[0091]
s151：在lb平板上划线接种受体菌大肠杆菌ecn，37℃培养至单克隆形成，挑单克隆入3ml lb，37℃，220rpm培养过夜；
[0092]
s152：在超净台中，分别吸取0.5ml供体菌和受体菌(od600均为0.8～1.0)入2支灭菌的1.5ml ep管，3000g室温离心5分钟沉淀菌体；小心吸弃液体培养基，菌体都用1ml lb培养基轻柔吹打悬浮洗涤；再离心一次，吸弃液体培养基；
[0093]
s153：洗涤后的两管菌体分别用0.5ml lb培养基轻柔悬浮，合并成1ml后加入5μldap(0.1m)，混匀；取100μl混合菌液点在接合平板的滤膜上，30℃静置吸干后倒置培养6小时；
[0094]
s154：接合平板，lb培养板添加0.5mm dap，使用前3～5天配好，待稍干燥后使用，滤膜为0.45μm孔径的混合纤维素膜，高压灭菌后待用，使用时，将一片滤膜用镊子夹取放到添加dap的lb平板上即可，注意铺平，与琼脂一面紧密贴合，不要有气泡；
[0095]
s155：接合反应结束后，用1ml lb培养基将滤膜上的菌体洗涤下来，注意菌体要充分悬浮均匀，不要有细胞团块；
[0096]
s156：取50-100μl接合后菌液铺含庆大霉素的lb平板，30℃培养至单克隆形成，在庆大霉素平板上筛选获得抗性的大肠杆菌克隆，其基因组整合有打靶质粒，称为ecn/pcvd442gm-δkfia::kfoa。
[0097]
s16：取数个ecn/pcvd442gm-δkfia::kfoa克隆菌液铺在含10％蔗糖的lb平板上，培养至单克隆形成，用kfia基因内部引物kfia-inf、kfia-inr进行菌落pcr反应，通过pcr技术筛选获得kfia基因被kfoa抗性基因取代的克隆，获得kfia已被kfoa基因替代的工程菌株ecn-a(ecn/δkfia::kfoa),内部引物鉴定pcr反应体系和条件如下：
[0098]
反应体系：
[0099]
菌液0.5μl10
×
taq buffer5μldntp(2.5mm)4μlkfia-inf(50pmol/μl)0.5μl
kfia-inr(50pmol/μl)0.5μltaq dna polymerase(5u/μl，mbi)0.5μldh2o39μltotal50μl
[0100]
反应条件：
[0101]
95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，7min。
[0102]
结果：
[0103]
鉴定结果显示随机挑选的22个单克隆中，第1号克隆为阴性扩增，证明其kfia基因缺失；其它21个单克隆均有189bp条带，说明kfia基因没有被替换，为假阳性菌落(图2a)。取第1号克隆的少量菌液用kfia基因外侧引物kfia-outf、kfia-outr进行pcr反应，有长度符合(替换菌株的扩增长度为2652bp)的特异性扩增产物，显示kfia基因已被kfoa基因替代(图2b)。将pcr扩增产物送测序验证，测序结果显示kfia位于翻译起始与终止密码之间的序列已被kfoa基因替代，该结果与设计一致。
[0104]
外侧引物鉴定pcr反应体系和条件如下：
[0105]
反应体系：
[0106]
菌液0.5μl10
×
taq buffer5μldntp(2.5mm)4μlkfia-outf(50pmol/μl)0.5μlkfia-outr(50pmol/μl)0.5μldmso2.5μltaq dna polymerase(5u/μl，mbi)0.5μldh2o36.5μltotal50μl
[0107]
反应条件：
[0108]
95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，2.5min；35个循环；72℃，7min。
[0109]
s2：工程菌株ecn-ac的构建
[0110]
以ecn-a为受体菌株，采用相同的方法，进一步用软骨素合成酶kfoc基因替换ecn-a菌株中的kfic基因(扩增kfic基因的上、下游同源重组手臂的引物为kfic-5fp、kfic-5r、kfic-3f、kfic-3rp；从e.coli k4基因组上扩增kfoc基因的引物为kfoc-f、kfoc-r)。通过将供体菌β2155/pcvd442gm-δkfic::kfoc与受体菌(ecn-a)菌液混合进行接合实验。然后用含10％蔗糖的lb平板进行反向筛选，获得kfic已被kfoc基因替代的工程菌株ecn-ac。用kfic基因内部引物kfic-inf和kfic-inr进行菌落pcr反应，鉴定结果显示随机挑选的14个单克隆中，有11个克隆为阴性扩增，证明其kfic基因缺失；其它3个单克隆均有378bp条带，说明kfic基因没有被替换，为假阳性菌落(图3a)。取第1号克隆的少量菌液用kfic基因外侧引物kfic-outf和kfic-outr进行pcr反应，有长度符合(替换菌株的扩增长度为3726bp)的特异性扩增产物，显示kfic基因已被kfoc基因替代(图3b)。将pcr扩增产物送测序验证，测序结果显示kfic位于翻译起始与终止密码之间的序列已被kfoc基因替代，该结果与设计一致。
[0111]
s3：工程菌株ecn-ac的验证
[0112]
为了进一步验证在工程菌株ecn-ac中同时存在kfoa与kfoc基因，重新合成了两对引物，即ecn-ac菌株中的kfoa上、下游检测引物kfoa-yanf、kfoa-yanr与kfoc上、下游检测引物kfoc-yanf、kfoc-yanr，对ecn-ac菌株进行pcr检测验证。如图4所示，泳道1为marker；泳道2为ecn野生株用kfoa上、下游检测引物验证kfia的结果，条带大小在1000bp-1500bp之间，与理论大小(1150bp)相符；泳道3为ecn-ac菌株用kfoa上、下游检测引物验证kfoa的结果，条带大小在1000bp-1500bp之间，与理论大小(1453bp)相符，说明kfia基因已经被替换为kfoa；泳道4为ecn野生株用kfoc上、下游检测引物验证kfic的结果，条带大小在1500bp-3000bp之间，与理论大小(2765bp)相符；泳道5为ecn-kfoac菌株用kfoc上、下游检测引物验证kfoc的结果，条带大小在3000bp-5000bp之间，与理论大小(3263bp)相符，说明kfic基因已经被替换为kfoc。
[0113]
表1本发明中使用的序列
[0114]
[0115]
[0116][0117]
实施例2
[0118]
本实施例提供ecn-ac的发酵培养与软骨素合成。
[0119]
经过上述的分子生物学方法分析，目的菌株ecn-ac在基因组结构上已经达到了设计目标，完成了kfoa/kfoc基因对原菌株kfia/kfic基因的替换。为了分析该工程菌株ecn-ac是否能合成并成功分泌高分子软骨素多糖到细菌培养液中，对该菌进行了摇瓶培养，并用化学酶法测定了ecn-ac培养液上清中的软骨素浓度。
[0120]
取菌种划线于lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。挑取单克隆于3ml m9c培养基(1.36g/l无水磷酸氢二钠，0.6g/l磷酸二氢钾，0.1g/l氯化钠，0.2g/l氯化铵,2mm硫酸镁,0.1mm氯化钙,0.4％葡萄糖，0.4％络蛋白氨基酸)，37℃培养约12h。用移液枪分别吸取500μl上述菌液，按1：100的比例转接至装有50ml m9c培养基的三角培养瓶中，37℃振荡培养约20h。将培养的菌液于12000r/min离心10min，收集上清，通过化学酶法测定软骨素浓度。
[0121]
称取硫酸软骨素c溶于m9c培养基中，配制成1mg/ml的溶液，作为外标。分别取3ml上述硫酸软骨素c溶液、目的菌株上清液与300μl 200mm tris-hcl(ph7.0)溶液混匀。混匀后分别用0.22μm滤器过滤，以去除残余菌体。取上述过滤后的溶液加入10kda 0.5ml超滤管，一次400μl，14 000g离心30min后弃滤液，重复此过程直至溶液加完。加400μl 20mm tris-hcl，14 000g离心20min，重复两次，去除培养液中小分子杂质。向超滤管加150μl 20mm tris-hcl(ph7.0)，冲洗膜两侧，倒置超滤管，1 000g离心2min，再加20mm tris-hcl(ph7.0)定容至200μl。加300μl 2mg/ml aschnac于定容后的溶液中，37℃水浴反应16h后，100℃煮3min，13 000g离心2min，收集上清。将上清加入10kda 0.5ml超滤管，14 000g离心30min，得到过滤液。过滤液干燥完全后加100μl ddh2o重悬，使用蒽酮-硫酸法测其在595nm处的od值。将硫酸软骨素c标准品溶液作为外标，ecnδkfia::kan作为阴性对照，计算出目的菌液中软骨素的浓度。
[0122]
如图5所示，cs为硫酸软骨素标准品；同时培养的菌株有ecnδkfia::kan，作为阴性对照，该菌株的kfia基因被敲除后，不能合成与分泌多糖到细胞外的培养液中；大肠杆菌k4δkfoe作为阳性对照，该菌的kfoe被敲除后，可以合成与分泌软骨素多糖到细胞外的培养液中。实验结果显示，致病性大肠杆菌k4δkfoe的上清液中，软骨素多糖产量为30mg/l；经过工程改造的益生菌ecn-ac的上清液中，软骨素多糖产量为21mg/l。大肠杆菌k4δkfoe与益生菌ecn-ac的摇瓶培养上清液中的多糖产量与已报道的野生菌株产糖量相似，说明该检测结果具有可靠性。该分析结果证明了ecn-ac合成并分泌了软骨素多糖到细胞外的培养液中。
[0123]
实施例3
[0124]
本实施例提供ecn-ac的分批补料发酵。
[0125]
为了进一步提高ecn-ac软骨素多糖的产量，本研究用ecn-ac进行了分批补料发酵。挑取单克隆于3ml m9c培养基，37℃培养约12h，再转接至250ml m9c培养基中，继续振荡培养过夜。将发酵罐清洗并灭菌。该发酵在5l发酵罐中进行，由分批生长期和补料分批生长期组成。分批阶段的培养基组成是m9c培养基，分批进料阶段使用的进料溶液由400g/l葡萄糖和20g/l mgso4·
7h2o组成，具体包括如下步骤：
[0126]
分批生长期：用m9c进行调零，测定菌液的od
600
，通过火焰接种将250ml培养物转移到5l发酵罐中的2.2l新鲜m9c培养基中，进行24h分批生长期发酵，将发酵温度保持在37℃，通过加入5m hcl和25％氨水将ph保持在约7.0，当泡沫超过发酵罐的数字控制单元的反馈回路控制的设定水平时，将消泡剂204/水(10％，v/v)溶液添加到培养物中，搅拌器速度设定为700rpm，空气以5l/min的速度喷射到培养物中。
[0127]
补料分批生长期：发酵24h后，进入补料分批生长期发酵，空气的速度增加到7l/min，喷射到培养物中，并开始分批增加进料。使用进料泵将进料溶液(400g/l葡萄糖和20g/lmgso4·
7h2o)添加到发酵罐中，并受固定的打开时间和更改的时间控制，进料泵的开启时间设为2s，周期时间由以下公式计算：t period＝vpump(ml/min)*2s/ms(t)(ml/min)＝533s/exp(0.138(t-t0))。其中t period是周期时间(小时)，vpump是进料泵的运行速率，ms(t)是通过公式ms(t)＝1.5*exp(0.138*(t-t0))，(t:发酵时间，h；t0：加料开始时间，h)。使用酸泵添加5m hcl，使用基本泵添加25％的氨水，以将ph维持在7.0左右，并为培养物提供氮源，当超过设定水平时，使用消泡泵将消泡剂204添加到培养物中，发酵40小时后，于6000r/m离心15min收集上清，通过化学酶法测定软骨素浓度。
[0128]
用化学酶法测定了ecn-ac培养液上清中的软骨素浓度，如图6所示，以硫酸软骨素(cs)为标准品，以空白培养液为阴性对照(control)，测定出ecn-ac菌株的发酵液胞外多糖产量为650mg/l。软骨素浓度测定结果显示，通过分批补料发酵，ecn-ac菌株的发酵液胞外多糖相对于摇瓶培养液上清中的多糖产量，提高了约30倍。
[0129]
综上所述，本发明以大肠杆菌k4菌株kfoa/kfoc基因替换了ecn菌株kfia/kfic基因，构建出了一株新的工程菌株ecn-ac，实现了软骨素多糖的合成与分泌。本研究进一步通过分批补料发酵，使软骨素多糖提高了30倍，为后续软骨素多糖的大规模纯化与硫酸化修饰奠定了基础。