释硅链霉菌CS13-6及其应用

释硅链霉菌cs13-6及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种属于环境微生物技术领域，具体涉及一种释硅链霉菌cs13-6及其应用。


背景技术：

2.我国50~80%以上的农田土壤si严重缺乏，20%以上的土壤受到cd、as、pb等重金属污染，土壤微生物多样性失衡，严重影响到农业生产与农产品的品质安全。硅肥的施用不仅可以提质增产，还可以调节土壤酸碱度、改良土壤结构、修复污染土壤等，对提高土壤生产力水平有明显促进作用。硅肥在全国越来越受到重视，一大批中小型硅肥企业应运而生。据不完全统计，我国硅肥年生产能力在100万t以上，但距离我国每年需求3000~5000万t的硅肥市场来说，硅肥生产还存在巨大的缺口和发展空间。
3.目前国内生产和施用的硅肥主要有两类：一类是人工合成的，如硅酸二钙（2cao
·
sio2）、硅酸一钙（cao
·
sio2）、硅酸钙镁（cao
·
mgo
·
sio2）、偏硅酸钠等，这种工艺生产出的硅肥有效硅含量大于50%，但价格昂贵，推广难度大，长期施用造成土壤结构破坏、有机质含量下降。另一类则是利用各种高炉水淬渣、磷渣、粉煤灰、废玻璃等工业固体废弃物加工而成的硅肥。虽然我国拥有丰富的硅肥生产原料，技术水平也在不断的提高，但是由于环保要求越来越严格，很大工业固废在生产农用肥料时受到很多限制条件。
4.因此，筛选挖掘新型释硅功能微生物，开辟效果好、成本低又不污染环境的微生物来开发土壤中的硅素资源，对发展绿色生态农业具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种不仅有释硅作用，还能解磷、解钾、固氮、产嗜铁素和iaa的释硅链霉菌cs13-6及其应用。
6.本发明采用如下技术方案：一种释硅链霉菌（streptomyces sp.）cs13-6，于2022年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no. 25523。
7.进一步的，所述释硅链霉菌cs13-6具有释硅能力。
8.进一步的，所述释硅链霉菌cs13-6具有溶磷、解钾、固氮能力。
9.进一步的，所述释硅链霉菌cs13-6具有产嗜铁素和iaa能力。
10.进一步的，所述释硅链霉菌cs13-6在初始培养基ph值为5~10时能很好生长。
11.进一步的，所述释硅链霉菌cs13-6兼具释硅能力、解磷解钾固氮和耐酸碱能力。
12.一种上述释硅链霉菌cs13-6在植物促生和/或土壤修复中的应用。
13.一种以上述释硅链霉菌cs13-6为有效成分生产的生物硅肥和/或土壤改良剂。
14.本发明的有益效果在于：本发明的释硅链霉菌cs13-6，在酸性或碱性土壤耐受性方面优势显著，定殖能力
强，可用于酸碱性土壤改良及质量提升；另外还可以为释硅、解磷解钾功能微生物的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济效益和广阔的应用前景。
15.利用本发明的释硅链霉菌cs13-6，可以用于尾矿区土壤生态复垦、缺硅土壤改良等。
16.利用本发明的释硅链霉菌cs13-6应用于土壤，不仅有释硅作用，还能解磷、解钾、固氮、产嗜铁素和iaa，不仅改善土壤养分，而且显著促进植物生长。
附图说明
17.图1为链霉菌cs13-6菌落图。
18.图2为链霉菌cs13-6气生菌丝图。
19.图3为链霉菌cs13-6孢子图。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
21.实施例1链霉菌cs13-6分离和保藏链霉菌cs13-6是从中国河北省承德铁矿尾矿砂样品中，通过梯度稀释平板法初筛、生物浸矿复筛等方法分离获得。
22.具体方法是：将采集回的样品研磨过200目筛制备成10-3
、10-4
、10-5
的3个稀释度菌悬液，均匀涂布于亚历山大罗夫培养基上，于30℃恒温培养箱中培养2~3天，挑取不同形态单菌落重复划线2~3次，直至获得纯培养，根据菌落形态初步判断为放线菌，并转接到高氏1号培养基斜面，4℃冰箱保存备用。
23.以铁尾矿砂为底物，以发酵液中有效硅含量的增加为标准，对初筛得到的单菌落接种至浸矿脱硅培养基内进行释硅能力复筛。发酵第5d时进行取样，发酵液离心取上清，用硅钼蓝比色法测定有效硅含量。
24.采用培养基：亚历山大罗夫培养基（g/l）：蔗糖5.0 g、na2hpo
4 2.0 g、mgso4·
7h2o 0.5 g、fecl
3 0.005 g、caco
3 0.1 g、土壤矿样1.0 g、琼脂15~20 g，ph调为7.0~7.4。
25.浸矿脱硅培养基（g/l）：葡萄糖10 g、kh2po
4 0.2 g、mgso4·
7h2o 0.2 g、nacl 0.2 g、cacl2·
2h2o 0.2 g、caco
3 5 g，ph为7.0~7.2。
26.高氏1号培养基（g/l）：kno
3 1 g、可溶性淀粉20 g、nacl 0.5 g、k2hpo4·
3h2o 0.5 g、mgso4·
7h2o 0.5 g、feso4·
7h2o 0.01 g、固体培养基需加琼脂 15~20 g，ph为7.4~7.6。
27.菌株cs13-6在高氏1号培养基上生长良好，菌落初期呈白色，菌落边缘整理，有凸起，气生菌丝白色有分支，后期产蓝色可溶性色素。孢子形态为椭圆形，孢子链呈螺旋状。可水解淀粉、液化明胶，能够在纤维素上生长，不能产生硫化氢性。该菌可以利用多种碳源（葡萄糖、甘露醇、d-半乳糖，l-鼠李糖、d-果糖、蔗糖、麦芽糖）和氮源（硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨和酵母浸粉）。
28.取培养72 h的菌丝体，送测序公司进行全基因组测序，采用mgi2000二代+ont三代测序，对组装的基因组进行分类学鉴定，确定该菌株与streptomycesregalis在分类学上最
接近，两个基因组间平均核苷酸相似度ani（average nucleotide identity）值为92.43（ani被定义为两个微生物基因组同源片段之间平均的碱基相似度，他的特点是在近缘物种之间有较高的区分度。相同物种的基因组ani大于95%，不同物种的基因组ani小于95%，因此常以95%的ani作为物种划分与物种聚类的标准），ani值小于95%，说明该菌株为链霉菌属中的新物种。
29.将菌株cs13-6于2022年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类学命名为：链霉菌streptomyces sp.，保藏编号为cgmcc no. 25523。
30.实施例2 链霉菌cs13-6释硅特性用接种环取少量纯菌株cs13-6接种于装有50 ml高氏1号培养基（如实施例1）的250 ml三角瓶中，28℃，180 r/min震荡培养72 h，得到活化菌种。
31.将cs13-6菌液以体积比5%分别接种于浸矿脱硅培养基中（如实施例1）。分别考察不同浸矿温度、初始ph、转速等因素对菌株cs13-6脱硅性能的影响。取5天的发酵液8000 r
·
min-1
离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜，采用nyt1121.15-2006硅钼蓝比色法测定培养后发酵液中有效硅含量。
32.实验结果表明，cs13-6脱硅的最适条件为：温度28~30℃，初始ph为6.0~7.0，转速150~180 r/min，有效硅含量达43.2 mg/l。
33.实施例3链霉菌cs13-6溶磷、解钾、固氮能力测定制备菌株cs13-6种子平板，点接于nbrip溶磷和解钾检测培养基上，于30℃恒温培养箱中培养3 d后，观察其生长情况及是否有溶解圈。
34.计算方法为：溶解能力＝溶解圈直径d/菌落直径d。
35.nbrip培养基：葡萄糖 10g、ca3(po4)
2 5 g、(nh4)2so
4 0.5 g、mgso4·
7h2o 0.25 g、kcl 0.2 g、mgcl2·
6h2o 5 g、琼脂15 g、0.4%溴酚蓝 6 ml、超纯水1 l，ph为7.0~7.2。
36.解钾培养基：10 g 蔗糖、1 g na2hpo4、0.5 g、(nh4)2so4、1 g mgso4·
7h2o、0.2 g酵母粉、0.1 g nacl、0.1 g caco3、0.005 g fecl3、5 g 钾长石、1 l 水。
37.测定结果表明：在nbrip溶磷检测培养基和解钾培养基中，cs13-6菌落周边均出现明显的透明圈，说明其具有一定的溶磷、解钾能力。
38.制备菌株cs13-6种子平板，挑去部分菌落接种于固氮活性检测培养基中，30℃培养3 d，观察其生长情况。转接3次后，菌株仍能够生长，说明cs13-6具有自生固氮功能。
39.固氮活性检测培养基（ashby无氮培养基）：甘露醇 10 g、kh2po
4 0.2 g、mgso4·
7h2o 0.2 g、nacl 0.2 g、caso4·
2h2o 0.2 g、caco
3 5 g，ph7.2。
40.检测结果表明：菌株cs13-6在固氮培养基连续转接3次还可以生长，说明该菌株具有固氮能力。
41.实施例4链霉菌cs13-6产嗜铁素和iaa测定嗜铁素产生能力：制备菌株cs13-6种子平板，接种针挑取部分菌落接于cas检测培养基上，30℃培养3 d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。
42.分泌iaa性能：制备菌株cs13-6种子平板，将部分菌落接种于高氏1号培养基中（含100 mg/l的l-色氨酸），置于30℃、180 r/min的摇床上振荡培养3~5 d，取经过8000 r/min离心后的上清液50μl，加入50μl salkowski比色液，滴在白瓷板上避光显色30 min后，若出
现粉红色则为阳性，表示该菌株能够分泌iaa，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌iaa。
43.实验结果表明，菌株cs13-6具有产iaa、嗜铁素的能力，具有较强的促进植物生长的能力。
44.实施例5链霉菌cs13-6的抗逆性实验制备菌株cs13-6种子平板，挑取部分菌落划线接种于不同初始ph （2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）、nacl含量（0、0.5％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、15％）的高氏1号培养基平板上，于30 ℃恒温养 2~3 d。同时将菌株cs13-6菌落划线接入高氏1号培养基平板，于不同温度条件下（4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、45℃、50℃）培养2~3 d，观察菌落生长情况。
45.结果表明，该菌株cs13-6可在ph 5~10正常生长。在培养基nacl含量4％时仍可正常生长，最适nacl浓度为0~0.5%，说明其具有一定的耐盐能力。菌株cs13-6在20~40℃均能很好生长，说明菌株cs13-6对逆境条件耐受能力强，具有高耐酸碱性、广适温特性。
46.实施例6 链霉菌cs13-6对蔬菜生长的影响将链霉菌 cs13-6 接种于高氏1号培养基上，于 28℃恒温培养箱中培养 5~8 d，刮取培养基表面孢子置于 20 ml 含有玻璃珠的无菌水中，28℃、220 rpm摇床振荡 20~30 min制成菌悬液，血球计数板计数，按照梯度稀释方法稀释为四个不同浓度，链霉菌cs13-6孢子浓度分别为 6
×
10 5 cfu
·
g ‑1、6
×
10 6 cfu
·
g ‑1、6
×
10 7 cfu
·gꢀ‑1、6
×
10
8 cfu
·
g ‑1。
47.随机挑选大小均匀、子粒饱满的健康生菜种子，利用70%乙醇和3% naclo 水溶液进行种子表面消毒。生菜育苗：基质由部分园林土、铁尾矿砂和蛭石复合而成，均匀平铺到育苗盘中，将生菜种子均匀洒在育苗盘上，在上面覆盖约0.5 cm 左右基质，浇水后不露种子即可。播种完成后育苗盘用水浇透，置于温室中培育。
48.生菜定植：待生菜长到三叶一心时，从育苗盘中选取大小一致的生菜苗移栽到直径15 cm的花盆中，盆栽土壤中加入不同浓度链霉菌cs13-6。实验设置5个处理，空白对照 ck 为清水对照，另外四个处理为链霉菌cs13-6孢子浓度分别为 6
×
10
5 cfu
·
g ‑1、6
×
10
6 cfu
·
g ‑1、6
×
10
7 cfu
·gꢀ‑1、6
×
10
8 cfu
·
g ‑1，每处理 10 盆，重复三次，白天室温设置为 28℃，光照 12 h，夜间室温设置为 24℃，黑暗时间为12 h，30~40 d 后测定生菜的单株产量、株高、叶片数、叶长和叶宽。
49.链霉菌cs13-6对盆栽生菜生长的影响如表1所示，不同孢子浓度的链霉菌 cs13-6均对生菜的生长具有促进作用，随着孢子量的增加，生菜的各项生长指标均有明显提升，当链霉菌 cs13-6孢子量为 6
×
10
7 cfu
·
g ‑1时，生菜的单株产量为57.3 g，株高为18.6 cm，叶片数为9.8，叶长和叶宽分别为17.9 cm 和13.1 cm，与对照组ck相比，均显著高于对照组相关指标，说明链霉菌cs13-6对盆栽生菜生长的促进效果明显，最显著的浓度为 6
×
10 7 cfu
·
g ‑1。
50.表1 链霉菌cs13-6对生菜植株生长的影响
。
51.注：结果为3个重复测定值的平均值（标准误）；不同小写字母表示处理间差异显著(p《0.05)。
52.实施例7 链霉菌cs13-6对土壤及植物生长的影响将菌株cs13-6利用高氏一号液体培养基发酵培养，摇床转速200 r/min，28℃培养3~5 d，制成菌悬液（或者制备孢子悬液，将孢子浓度调整为1
×
10
8 cfu/ml）备用，按照100 ml
·
kg-1
拌入基质，基质是由部分园林土、铁尾矿砂和蛭石复合而成。对照则在基质中拌入相同体积的无菌水，进行玉米盆栽实验。置于25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，每组设10个重复，定期补水。另外，实验组每隔10~15 d，在每个盆中浇施补充5~10 ml发酵液或孢子悬液，对照补充相同数量的无菌水，定期观察记录植株的形态特征。2个月后对土壤和植株（玉米）的地上指标及根系生长状况进行测定。
53.表2 链霉菌cs13-6对玉米植株生长的影响。
54.表3 链霉菌cs13-6对土壤肥力的影响。
55.结果显示（见表2）：玉米在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，特别是在株高、干重、叶绿素含量等方面差异显著。分析结果见表3所示。同时可以显著提高土壤中有效硅、速效钾和有效磷的含量。
56.根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。