发光RNA适配体结合放大与转录系统及DNA甲基化酶活性检测方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种发光rna适配体结合放大与转录系统及dna甲基化酶活性检测方法。

背景技术：

1、dna甲基化是一个表观遗传过程，涉及许多重要的生物学过程中的基因表达调控。它是由dna甲基转移酶(dna methyl-transferase,mtase)选择性催化的，该酶可以将细胞s-腺苷-l-蛋氨酸(sam)的c-5位置的碱基甲基化。大多数dna甲基化发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的跨启动子区域，从而导致基因表达中的转录沉默。研究表明，dna甲基转移酶活性异常与重大疾病癌症的发生和发展息息相关，所以可以通过抑制dna甲基转移酶的活性在早期阻断dna甲基化来实现控制疾病的目的。因此，实现dna甲基转移酶活性的高灵敏检测，对生物医学研究、临床诊断和癌症治疗具有重要意义。

2、传统的dna分析方法因会去除甲基化信号而不适合监测dna甲基化酶活性。目前，常用的检测dna甲基转移酶的方法主要有放射性同位素标记、高效液相色谱(hplc)、表面增强拉曼光谱(sers)、甲基化目标聚合酶链反应(pcr)、电化学和荧光法。然而，这些方法的广泛使用仍存在一定的问题。放射性标记需要危险的化学物质，电化学和sers的方法背景高且信号不稳定，hplc需要复杂的样品前处理过程，pcr需要严格的加热和冷却循环，荧光的方法则需要荧光探针标记。由于甲基化在生物系统中的重要作用，探索一种低背景、无标记和超灵敏的方法来评估dna甲基化酶活性迫在眉睫。

3、2011年，康奈尔大学s.jaffrey研究小组筛选出了一种rna适配体，它与本来不发光的gfp生色团小分子3，5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(dfhbi)特异性结合后，可以发出类似gfp的绿色荧光，该适配体最终以蔬菜的名字命名为spanish，打开了荧光适配体开发的大门。自此，由于rna荧光适配体高亮度、良好的可编程性、低背景和小尺寸的优势，引起了科研学者的广泛关注。这类适配体由两部分组成，体外筛选的rna序列和相应的结合染料。该适配体-染料系统有三个特点。首先，该染料游离时无荧光，只有与rna适配体结合时荧光才会呈指数级增强，故特异性好，背景低。其次，它们的荧光增强是基于rna适配体-染料对的相互作用，不依赖于复杂的目标rna基因工程或荧光染料对dna或rna的修饰。第三，rna适配体具有较高的可编程性，即使与其他适配体或启动子融合后仍能保持其特征，使其成为高度选择性的复杂系统。例如，樊春海课题基于这种荧光适体实现了mrna的活细胞成像，实现了细胞内β-actin mrna的定性分析和原位成像，在mrna的体内可视化分析中具有潜在的应用价值。meier等人设计了功能性核蛋白开关，并提出了几种设计发光rna适配体传感器的原则。徐静娟课题组基于corn-dfho尺寸小，生物相容性好及优异的光稳定性，针对活细胞内肿瘤相关的微小rna，开发新型目标物诱导的rna探针精确自组装方法，将其直接应用于单细胞层面上内源性微小rna的原位监测。然而，这些基于点亮rna适配体的“一对一”触发模型的传感工作不适用于低浓度目标分析或成像。因此，有必要发明新的基于rna适配体的检测策略实现痕量目标物的检测。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种发光rna适配体结合放大与转录系统的构建方法，以及基于该系统建立了一种dna甲基化酶活性检测方法和影响dna甲基化活性物质的筛选方法，为复杂系统中微量dna甲基转移酶的定量提供了一种实用的方法。本发明开发的特异性好、灵敏度高的dna甲基化酶检测方法在肿瘤早期诊断和肿瘤精准治疗中具有重要作用。

2、本发明的第一个目的是提供一种发光rna适配体结合放大与转录系统的构建方法，包括以下步骤：

3、s1、将第一引物与第二引物共孵育；所述第一引物上包括相连的第一序列和第二序列，所述第一序列与第二引物互补；

4、s2、向步骤s1的体系中加入环形锁挂探针进行滚环扩增，形成单链dna；所述环形锁挂探针的部分序列与第二序列互补；所述环形锁挂探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、s3、向步骤s2扩增完成的体系中加入第三引物，所述第三引物以滚环扩增得到的单链dna为模板形成dna双链；

6、s4、将步骤s3得到的dna双链进行体外转录，向转录后的体系中加入3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮(dfhbi)，得到所述发光rna适配体结合放大与转录系统。

7、进一步地，seq id no.1所示序列具体如下，其中，划线部分即为步骤s2中所述环形锁挂探针中与第二序列互补的部分：

8、ctactatctcagggagctcacactctactcaacagcgcgaacgctggacccgtccttctcccgccctatagtgagtcgtattaaactaaacaac。

9、进一步地，所述第一引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。具体如下，其中，划线部分为与部分环形锁挂探针互补的第二序列，加粗部分为与第二引物互补的第一序列：

10、

11、进一步地，所述第二引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。具体序列如下：

12、

13、进一步地，所述第三引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。具体序列如下：

14、taaactaaacaacctactatctca。

15、进一步地，在步骤s3中，滚环扩增得到的单链dna含有编码发光rna适配体的序列，其可与染料分子(如dfhbi)结合产生荧光。

16、进一步地，在步骤s2中，滚环扩增体系中，除环形锁挂探针外，还包括dntps和phi29 dna聚合酶。

17、进一步地，在步骤s3和s4中，以滚环扩增得到的单链dna为模板形成dna双链时，先加入第三引物，经klenow酶延伸补平，随后在rna聚合酶的作用下形成rna，体外转录后得到与dfhbi特异性结合产生荧光的蛋白。

18、本发明的放大与转录系统中，第一引物与第二引物完全互补，且含有一段延长部分(即第二序列)，该延长部分与部分环状模板互补，可作为rca滚环扩增的dna引物，在phi29 dna聚合酶催化下将dntps转变成单链dna，此单链dna包含成百上千个重复的模板互补片段，而该单链dna中共同含有的序列经过体外转录后可以结合染料分子发出荧光，且该染料分子在结合前不发生荧光，因此通过荧光强度的检测可实现微小信号的放大。除此之外，本发明之所以能够实现如此优异的效果源于环形锁挂探针，发明人设计了一种独特的环形模板，只有和延长部分互补后才能引发滚环扩增反应，进而进行后续的步骤。

19、本发明的第二个目的是提供上述构建方法构建得到的发光rna适配体结合放大与转录系统。

20、本发明还要求保护上述系统在物质检测中的应用，尤其是在制备疾病诊断试剂中的应用，为复杂系统中微量待测物质的定量提供了一种新的方式。

21、本发明的第三个目的是提供一种dna甲基化酶活性检测方法，包括以下步骤：

22、s1、将第一引物与第二引物共孵育形成引物复合物；所述第一引物上包括相连的第一序列和第二序列，所述第一序列与第二引物互补；

23、s2、向步骤s1的体系中加入待测dna甲基化酶进行孵育，随后加入限制性内切酶进行孵育；所述限制性内切酶特异性切割未被所述dna甲基化酶甲基化的引物复合物，且无法切割被所述dna甲基化酶甲基化的引物复合物；

24、s3、向步骤s2的体系中加入环形锁挂探针进行滚环扩增，形成单链dna；所述环形锁挂探针的部分序列与第二序列互补；所述环形锁挂探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；

25、s4、向步骤s3扩增完成的体系中加入第三引物，所述第三引物以滚环扩增得到的单链dna为模板形成dna双链；

26、s5、将步骤s4得到的dna双链进行体外转录，向转录后的体系中加入3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮(dfhbi)，根据荧光强度检测所述待测dna甲基化酶的活性。

27、进一步地，所述第一引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

28、进一步地，所述第二引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。

29、进一步地，所述第三引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

30、进一步地，在步骤s1中，所述第一引物或第二引物上修饰有亲和素。

31、进一步地，在步骤s2中，向孵育后的体系中加入链霉素修饰的磁珠进行孵育。

32、进一步地，在步骤s2中，在本发明的一个实施例中，待测dna甲基化酶为cpg甲基转移酶(m.sssi)，限制性内切酶为hpaii。

33、进一步地，在步骤s3中，滚环扩增体系中，除环形锁挂探针外，还包括dntps和phi29 dna聚合酶。

34、进一步地，在步骤s4和s5中，以滚环扩增得到的单链dna为模板形成dna双链时，先加入第三引物，经klenow酶延伸补平，随后在rna聚合酶的作用下形成rna，体外转录后得到与dfhbi特异性结合产生荧光的蛋白。

35、本发明的检测方法中，若dna甲基化酶的活性足以将第一引物和第二引物形成的引物复合物甲基化，在加入限制性内切酶后，限制性内切酶无法进行酶切(即dna甲基化酶保护引物复合物不被限制性内切酶消化)，那么在加入环形锁挂探针后能够正常进行rca滚环扩增，形成的发光rna适配体能够与染料分子结合发出荧光；若dna甲基化酶的活性不足以将引物复合物甲基化，由于限制性内切酶特异性切割未经甲基化的引物复合物，在加入限制性内切酶后引物复合物会被切去不平整末端，无法进行滚环扩增，相应的荧光强度也消失，因此通过建立酶活与荧光强度的线性模型即可得出dna甲基化酶的活性。

36、本发明的第四个目的是提供一种影响dna甲基化活性物质的筛选方法，包括以下步骤：

37、s1、将第一引物与第二引物共孵育形成引物复合物；所述第一引物上包括相连的第一序列和第二序列，所述第一序列与第二引物互补；

38、s2、向步骤s1的体系中加入待测dna甲基化酶和待测物质进行孵育，随后加入限制性内切酶进行孵育；所述限制性内切酶特异性切割未被所述dna甲基化酶甲基化的引物复合物，且无法切割被所述dna甲基化酶甲基化的引物复合物；

39、s3、向步骤s2的体系中加入环形锁挂探针进行滚环扩增，形成单链dna；所述环形锁挂探针的部分序列与第二序列互补；所述环形锁挂探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；

40、s4、向步骤s3扩增完成的体系中加入第三引物，所述第三引物以滚环扩增得到的单链dna为模板形成dna双链；

41、s5、将步骤s4得到的dna双链进行体外转录，向转录后的体系中加入3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮(dfhbi)，根据与未加入待测物质体系的荧光强度差异筛选出对dna甲基化有影响的物质。

42、进一步地，若加入待测物质的体系与未加入待测物质的体系相比，荧光强度增加，说明该待测物质能够增强dna甲基化；若荧光强度减弱，说明该待测物质能够抑制dna甲基化。

43、本发明的第五个目的是提供一种用于滚环扩增的环形锁挂探针，所述环形锁挂探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。

44、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

45、本发明设计了一种基于rna适配体的双重扩增和转录策略，用于对微量cpg甲基转移酶进行无标记和超灵敏检测。通过磁珠/dna表面触发协同级联滚转环扩增(rca)和rna转录过程，产生长度不同的与染料分子高亲和力的串联spinach序列，从而产生显著的荧光增强。该策略线性范围宽0.02-100u/ml，检出限降低到0.0016u/ml。更重要的是，由于该平台的独特特性，包括敏感的限制性内切酶、基于挂锁的识别和rna转录，确保了在复杂系统中分析dna甲基化酶和其抑制剂活性评估的特异性。

46、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。