人乳杆菌LHM11及菌剂和应用

人乳杆菌lhm11及菌剂和应用
技术领域
1.本发明是涉及微生物领域，具体涉及人乳杆菌lhm11及菌剂和应用。


背景技术：

2.目前，雄性动物的雄性不孕不育率大幅度提高，主要是因为雄性生殖系统更容易受环境因素的影响。然而现在还没有良好的方法改善精液品质从而治疗雄性不孕不育。近年来研究发现肠道菌群与人及其他动物的健康息息相关，然而肠道菌群与雄性生殖轴的关系还没有确认，虽然已经有研究发现肠道菌群混合物可以改变雄性动物的精液品质，有益的肠道有益菌群可以改善动物的精液品质，但是还没有报道具体是哪种有益菌可以起到改善动物精液品质，提高雄性动物繁殖力，也没有任何文献公开哪种具体的肠道菌可以提高雄性繁殖力。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11。
4.本发明的另一目的是提供包含上述人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的菌剂。
5.本发明的另一目的是提供上述人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的应用。
6.本发明的人乳杆菌m11，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为人乳杆菌lactobacillus hominis，保藏编号为cgmcc no.25327。
7.本发明提供含有人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的菌剂，所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
8.本发明提供了人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11用于制备以下用途的制剂的用途，（1）改善肠道健康；（2）改善血液及睾丸代谢组；（3）增加雄性动物精子浓度；（4）增加雄性动物精子活力；（5）提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率；和/或（6）提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数。
9.本发明的目的是提供一种人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11，该菌能改善动物机体代谢，增加有益的代谢产物，从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸（调控精子发生的起始），从而提高雄性动物的精子质量和繁殖力；而且人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
附图说明
10.图1为本发明的人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的生长曲线(mrs培养基)；图2显示本发明实施例2中试验小鼠在试验周期35天体重变化情况；图3显示本发明实施例2中试验小鼠的精子浓度；图4显示本发明实施例2中试验小鼠的精子活力；图5显示本发明实施例2中试验小鼠的精子顶体完整性；图6显示本发明实施例2中试验小鼠的精子的畸形率；图7显示本发明实施例2中试验小鼠的怀孕率；图8显示本发明实施例2中试验小鼠的产活仔数；图9显示本发明实施例3中试验公猪的采精量；图10显示本发明实施例3中试验公猪精子的浓度；图11显示本发明实施例3中试验公猪精子的活力；图12显示本发明实施例3中试验公猪精子的顶体完整性；图13显示本发明实施例3中试验公猪精子的畸形率；图14显示本发明实施例4中试验公牛精子的浓度；图15显示本发明实施例4中试验公牛精子的活力；图16显示本发明实施例4中试验公牛精子的顶体完整性；图17显示本发明实施例4中试验公牛精子的畸形率。
11.本发明的人乳杆菌m11，分类命名为人乳杆菌lactobacillus hominis，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.25327。
具体实施方式
12.本发明验证了人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11（以下实施例缩写为lhm11）对雄性动物繁殖力的有益作用，以白消安（busulfan）建立小鼠弱精、少精症模型，发现该菌株能够提高精子浓度、活力、顶体完整性，降低精子畸形率，提高雄鼠与正常雌鼠交配的成功率，交配后母鼠的怀孕率、产活仔数。夏季高温高湿会导致公猪、公羊精液品质下降，从而导致母猪、母羊怀孕率和产活仔数减少，lhm11可以提高夏季高温高湿状态下公猪和公羊的精子浓度和活力、顶体完整性，降低精子畸形率。
13.实施例1人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的分离1、菌株分离：人乳杆菌lactobacillus hominis分离自肠道内容物。取肠道内容物，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取合适稀释度的稀释液0.1ml在mrs琼脂上均匀涂布，37
°
c培养48h后， 将生长出的菌落通过平板划线接种到新的mrs固体培养基进行纯化培养48h。
14.2、菌株富集：将纯化培养后的菌株，在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌mrs肉汤培养基中，置于摇床中，37
°
c培养48h后进行16s rrna鉴定，并将剩余部分与含有25%甘油的生理盐水混合，保存至-80
°
c冰箱。
15.3、16s rrna鉴定：将富集后的菌液，使用细菌通用引物进行菌落pcr扩增后,进行16s rdna测序鉴定，在ncbi上将各个菌株的16s rdna序列与数据库中所有已测定细菌的16s rdna序列进行比对，其中发现有5株与人乳杆菌属的lactobacillus hominis jcm 18988的16s rdna 序列的同源相似性最高，相似度大于或等于99.8%，确定这5株菌种类别为人乳杆菌 (lactobacillus hominis)。
16.实施例2人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11的特性检测1、人乳球菌lhm11的微生物学特性如下:（1）菌落形态：圆形单菌落，直径大约1~2mm，乳白色，不透明，菌落表面光滑有微微的凸起，边缘是规则的。
17.（2）染色后细菌形态呈现短杆状，无鞭毛，不能运动。
18.（3）生长特性：在mrs液体培养基中，置于37
°
c摇床培养，5小时后开始进入对数生长期，14h进入平台期，最大活菌数为3.09
×
108cfu/ml （图1）。
19.2、耐胆盐检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100ml的无菌生理盐水中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
20.结果显示（表1），在0.3g/100ml的胆盐浓度下，与其它4株人乳杆菌比较，人乳杆菌(lactobacillus hominis)m11具有最好的耐胆盐能力，存活率在21.33%左右。
21.表1人乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%
22.3、耐人工胃液检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml ph=1.5的人工胃液中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
23.结果显示（表2），在ph=1.5的人工胃液1h后，与其它4株人乳杆菌比较，lhm11具有最好的耐人工胃液能力，存活率在 20.15%左右。
24.表2人乳杆菌在ph=1.5的人工胃液中的存活率%
25.4、耐人工肠液检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml ph=6.8的人工胃液中，4h后采用平板涂布法测定活菌数。
26.结果显示（表3），在人工肠液4h后，与其它4株人乳杆菌比较，lhm11具有最好的耐人工肠液能力，存活率在22.12%左右。
27.表3人乳杆菌在人工肠液的存活率%
28.实施例3人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11对白消安模型雄性小鼠繁殖力的影响在确定人乳杆菌lhm11菌株具有最好的益生特性，保留人乳杆菌lhm11菌株用于后续实验。
29.一、实验方法1、选取100只21日龄的icr雄性小鼠，饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中，将鼠房的温度控制在22
±
2℃，光照/黑暗时间为12小时，并自由取食和饮水。
30.2、将所有小鼠随机分为5组（每组20只小鼠）：对照组（con组），白消安组（b组），b+lhm11(10^6)组，b+lhm11(10^8)组，b+lhm11(10^10)组。con组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；b组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；b+lhm11(10^6)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
106cfu/ml的菌液，为期14天；b+lhm11(10^8)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
108cfu/ml的菌液，为期14天；b+lhm11(10^10)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
10
10
cfu/ml的菌液，为期14天。然后所有小鼠正常饲养21天（3周），不做任何处理，试验过程中，每天测量小鼠体重，观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。总计35天后（14天+21天），第36天，每组随机选取10只小鼠，收集样品进行分析。每组剩余的10只小鼠与正常母鼠交配，每只公鼠与2只母鼠交配，交配4天。交配4天后母鼠单笼饲养，公鼠收样检测分析。交配21天后统计母鼠怀孕率，产活仔数。
31.二、检测指标1、试验期间，每2天统计小鼠体重一次。
32.2、测量公鼠精子浓度、活力、顶体完整性、畸形率。
33.3、交配21天后统计母鼠的怀孕率、产活仔数。
34.4、并检测公鼠的血液指标和睾丸代谢物。
35.三、实验结果1、生长情况：整个试验中小鼠生长变化情况如图2所示，白消安导致小鼠体重增长变慢，从处理的第5天白消安组（b）的体重要低于对照组，而且一直到实验结束，白消安组体重显著低于对照组，而白消安处理后饲喂lhm11的3个组的体重要高于白消安组。
36.2、精子浓度：如图3所示，白消安模型组小鼠的精子浓度远远低于对照组，白消安处理后饲喂lhm11的3个组的精子浓度远远高于百消安组，几乎达到对照组的水平。
37.3、精子活力：如图4所示，白消安模型组小鼠的精子活力远远低于对照组，白消安
处理后饲喂lhm11的3个组的精子活力远远高于百消安组，几乎达到对照组的水平。
38.4、精子顶体完整性：如图5所示，白消安模型组小鼠的精子顶体完整性变差，远远低于对照组，白消安处理后饲喂lhm11的3个组的精子顶体完整性远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平。
39.5、精子畸形率：如图6所示，白消安模型组小鼠的精子畸形率远远高于对照组，白消安处理后饲喂lhm11的3个组的精子畸形率远远低于白消安组，与对照组的水平相当。
40.6、怀孕率：如图7所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远低于对照组，白消安处理后饲喂lhm11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平。
41.7、产活仔数：如图8所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远少于对照组，白消安处理后饲喂lhm11的3个组的小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远多于百消安组，几乎达到对照组的水平。
42.8、另外，对处理后的公鼠的血液和睾丸代谢物分析发现，白消安增加了血液及睾丸中有害代谢物，减少有益代谢物。而白消安处理后饲喂lhm11增加血液及睾丸有益代谢物如谷胱甘肽、视磺酸及总还原能力等。
43.实施例4人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11对公猪精液品质的影响一、实验方法选用公猪站里健康公猪40头（2 ~ 3岁），体重大约300公斤（kg）。所有公猪分别被圈养在封闭的猪舍内，并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
44.所有公猪被随机分为4个组：对照组（con）；lhm11(10^9)组；lhm11(10^12)组；lhm11(10^15)组；每组10头公猪。con组：饲喂商用饲料；lhm11(10^9)组：饲喂商用饲料+109cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11(10^12)组：饲喂商用饲料+10
12
cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11(10^15)组：饲喂商用饲料+10
15
cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），每天饲喂2次，定量饲喂。试验过程中，观察并记录公猪的状态。70天后收取公猪精液，并测试分析。
45.二、检测指标1、试验期间，每天统计公猪的体征。
46.2、第71天开始检测公猪的精液品质。
47.三、实验结果1、采精量：如图9所示，饲喂lhm11的3个组的采精量多于对照组。
48.2、精子浓度：如图10所示，饲喂lhm11的3个组的精子浓度高于对照组。
49.3、精子活力：如图11所示，饲喂lhm11的3个组的精子活力高于对照组。
50.4、精子顶体完整性：如图12所示，饲喂lhm11的3个组的精子顶体完整性高于对照组。
51.5、精子畸形率：如图13所示，饲喂lhm11的3个组的精子畸形率低于对照组。
52.实施例5人乳杆菌(lactobacillus hominis) m11对公牛精液品质的影响一、实验方法选用健康公牛40只（2 ~ 3岁），体重大约1000公斤（kg）。所有公牛分别被圈养在封
闭的牛舍内，并提供常规饲料（精料和草料）和自由饮水。牛圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
53.所有公牛被随机分为4个组：对照组（con）；lhm11(3
×
10^9)组；lhm11(3
×
10^12)组；lhm11(3
×
10^15)组；每组10只公牛。con组：饲喂常规饲料；lhm11(3
×
10^8)组：饲喂常规饲料+3
×
109cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11(3
×
10^12)组：饲喂常规饲料+3
×
10
12
cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11(3
×
10^15)组：饲喂商用饲料+3
×
10
15
cfu/头/天乳杆菌lhm11；lhm11饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），定量饲喂。试验过程中，观察并记录公牛的状态。70天后收取公牛精液，并测试分析。
54.二、检测指标1、试验期间，每天统计公牛的体征。
55.2、第71天开始检测公牛的精液品质。
56.三、实验结果1、精子浓度：如图14所示，饲喂lhm11的3个组的精子浓度高于对照组；2、精子活力：如图15所示，饲喂lhm11的3个组的精子活力高于对照组；3、精子顶体完整性：如图16所示，饲喂lhm11的3个组的精子顶体完整性高于对照组；4、精子畸形率：如图17所示，饲喂lhm11的3个组的精子畸形率低于对照组。
57.与同属种的人乳杆菌相比，lhm11最大的优势是具有提高雄性动物繁殖性能的特性。而且在人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
58.以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。