一种基于全自动数字PCR一体机的单细胞检测方法与流程

一种基于全自动数字pcr一体机的单细胞检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种单细胞检测的方法，具体涉及一种使用数字pcr仪器对单细胞进行检测的方法，特别涉及一种使用全自动数字pcr一体机进行单细胞检测的方法。


背景技术：

2.随着现代生物学的发展和社会需求的不断提高，仅分析细胞群体的核酸序列已经不能满足需要，有必要对单细胞进行检测和测序。
3.为满足以上需求，发展出了qpcr技术，其基本原理是，通过荧光活化细胞分选、免疫磁性富集、显微抽取、流式细胞术、激光捕获显微切割或各种自动化的设备，例如哈佛大学的液滴测序技术(drop-seq)来收集单个细胞，进行裂解并收集和提纯核酸物质，扩增和测序。
4.然而，以上的操作仍然是非常繁琐的，分离出的细胞需要转移到对应的微反应体系中进行裂解和核酸物质的提取与纯化，之后再转移到对应的微反应体系，或者加入扩增原料进行扩增。在需要对大量细胞进行以上操作时，即使完全自动化完成，效率也是较为低下的。在不同的步骤中使用的酶和原料也可能相互干扰，导致难以进行一站式操作。
5.数字pcr是一种核酸分子绝对定量技术，其采用微流控或微液滴化方法，将稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微液滴中，每个反应器的核酸模板数少于一个或等于一个，经过pcr循环后，有核酸分子模板的反应器会给出荧光信号，没有模板的反应器没有荧光信号，从而可以推测出原始溶液的核酸浓度。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤一：制备单细胞分离体系；所述单细胞分离体系包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和taq酶；步骤二：使用全自动数字pcr一体机，将所述单细胞分离体系分散成至多包含一个细胞的微液滴，并使微液滴平铺在数字pcr检测板上；步骤三：在明场和荧光场观察，对包裹有细胞的微液滴计数；步骤四：热裂解细胞，在荧光下观察微液滴，对仍能够观察到存在细胞形态的微液滴进行即时计数，并计算细胞裂解率，直至细胞裂解率达到预设值，细胞裂解率=(步骤三中包括有细胞的微液滴数-仍具细胞形态的微液滴数)/步骤三中包括有细胞的微液滴数；步骤五：升温至95℃继续加热10-20分钟，优选15分钟，以启动taq酶，并降温退火，完成第一次扩增；循环进行预定次数的扩增，统计高亮微液滴数。
7.所述全自动数字pcr一体机，指将在一台设备上实现全自动微液滴生成、pcr扩增、荧光信号收集的数字pcr仪器。示例性的型号如：sniper公司的dq-24，赛默飞公司的applied biosystems
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quantstudio
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absolute q
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等，不同厂商的型号在处理能力上有所区别，但均不影响实施本发明的技术方案。
8.作为优选，步骤二中，使用全自动数字pcr一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.3至1.5nl之间的数值，更优选地，设定0.6至1.0 nl的数值。
9.作为优选，步骤二中观察发现微液滴有重叠时，加热到60℃，使微液滴平铺。实验中发现，通过加热可以在5分钟内使微液滴有效平铺，因此加热时间可以统一设定为5分钟，也可以在观察到重叠消失后停止加热。
10.在步骤三、步骤四和步骤五中，可以人工计数，也可以自动计数和计算。
11.作为优选，热裂解细胞的温度为85℃。如果裂解操作过程中发现仍然含有完整细胞形态的微液滴较多，则证明裂解尚未完成，应当延长裂解时间，和/或提高温度。直至裂解率达到预设标准。作为示例，可以设定裂解率不低于80%、90%、95%或其他数值作为预设标准，也可以根据检测精度需要设定其他数值。测定裂解率的另一个好处是，即使裂解效果不佳，也可以根据该数值对最终测定结果进行数值修正和误差预估，例如裂解率为80%，则可以在计算突变细胞总数时，将最终结果中的高亮液泡数
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0.8，如需要计算突变率，也可以使用例如本发明实施例6中的计算方式来修正。本领域技术人员也可以根据需要，根据检测得到的数据，进行各种后期的数据修正和估算。裂解完成后如果视野有荧光信号，证明裂解成功且有感兴趣的细胞，启动裂解、扩增和检测过程。即使未发现整体有高亮荧光信号的微液滴，可能是荧光信号不够强，需要扩增若干轮再统计其中高亮的微液滴数。最终统计的高亮微液滴数即为该检测板上具有与引物所对应的特定基因的细胞的数量。
12.当待测细胞含有两种或两种以上类型的细胞时，作为一种方案，对其中至少一种细胞单独染色，使其可以在荧光下与其他类型的细胞区分和单独计数。所述单独染色是指，仅对待测细胞中的一种细胞进行荧光染色，或者使某种待测细胞与其他待测细胞的荧光染色颜色不同。本发明中，为展示技术效果，采用提前单独染色的细胞进行实验，本领域技术人员容易想到的是，面对混合的多种细胞时，可以通过例如特异性抗体偶联荧光染色剂的方式对其中感兴趣的某种细胞进行单独染色。此种技术手段是常规的，因此不再单独给出示例。作为另一种方案，还可以设置所述单细胞分离体系含有的引物和对应的探针能够检测特定位点，所述特定位点是待测细胞中的一种所特有的。采用该方法能够识别出不同类型的细胞，也可以识别出同类型细胞里发生了特定的基因突变的少量细胞，从而进一步提高检测精度和拓展本技术的应用范围。作为优选，当步骤三中未发现单独荧光染色的细胞时（整个视野无荧光点），停止该数字pcr检测板的检测，不进行后续的裂解和扩增。如此可以节省检测的时间和机器的占用。
13.当待测细胞中可能含有多种类型的表达或突变时，还可以在所述单细胞分离体系中设置检测不同位点的多种引物和探针，对应不同位点的多种探针的发光颜色不同。目前市售的全自动数字pcr一体机一般具有多个荧光检测通道，可以检测不同波长的荧光。通过该优选的方法，可以区分不同类型的表达或突变。
14.本发明还进一步提供所述单细胞分离体系，包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和taq酶。荧光染色是生物实验室的常规操作，其余原料均有市售产品，可以分别购买，也可以购买包含多种成分的预混液用于稀释和混合配制。本领域技术人员知晓检测不同细胞时如何选择引物和探针。
15.本发明技术方案与现有技术相比，至少具有以下一项有益效果：第一，通过即时监测，保证包裹和裂解的成功率，防止出现漏检。并且可以使用中
间数据修正最终数据和估计误差范围。
16.第二，在存在多种细胞时，能够及时识别出感兴趣的细胞，进行裂解和扩增，从而缩短检测时间，减少后续数据处理的压力。
17.第三，能够同时完成定量和定性检测，既能检测出突变的类型，又能检测出该类型突变细胞的个数。
附图说明
18.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为实施例1中采用荧光显微镜对hek293t细胞的染色情况观察结果照片。
19.图2为实施例1中在明场和荧光场下观察微液滴包裹细胞的情况照片。
20.图3为实施例2采用全自动数字pcr一体机观察hek293t细胞gadph扩增情况照片。
21.图4为实施例3中采用荧光显微镜对h-1975细胞的染色情况观察结果照片。
22.图5为实施例3中在明场和荧光场下观察微液滴包裹h-1975细胞的情况照片。
23.图6为实施例4采用全自动数字pcr一体机观察h-1975细胞t790m基因突变情况的照片。
24.图7为实施例5中采用全自动数字pcr一体机观察经染色和未染色的细胞的照片。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。
26.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
27.实施例1hek293t细胞单细胞分离及验证1.活细胞染色前处理本研究所用到的细胞为实验室保存的hek293t细胞，在细胞进入指数生长期时进行细胞悬液的制备，随后使用钙黄绿素am (calcein am) 进行活细胞染色。具体操作步骤如下：观察细胞状态，在其进入指数生长期时进行细胞悬液的制备。去掉培养基，使用2 ml的1
×
pbs分别洗涤细胞两次，并去除干净。加入500 μl的胰蛋白酶 (市售试剂)，并于室温消化1分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁，使得消化后的细胞脱离培养瓶底部。加入2 ml的新鲜培养基dmem (gibco，美国) (10%fbs，1%青霉素-链霉素混合液) 终止消化，并转移到15 ml离心管中。在125 g条件下，室温离心5 分钟后，去掉上清；使用1 ml 1
×
pbs洗涤细胞，以去除残留的培养基。用新鲜的1
×
pbs重悬细胞并用countesstm 3系列自动细胞计数仪 (thermofisher，美国)进行细胞数量测定。
28.2.细胞荧光染色本实验使用钙黄绿素(calcein am) (beyotime，c2012)进行活细胞荧光染色。其
操作方法为：用1
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pbs缓冲液将2 mm的calcein am稀释成浓度为2
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m染色工作液。按照1
×
106个/ml的浓度进行活细胞染色。采用荧光显微镜 (nikon公司ni-u型号)对染色情况进行观察(结果如图1所示，其中图1中标注为a的照片为明场观察结果，图1中标注为b的照片为荧光场观察结果。通过图1可以看出，采用calcein am染色的方法，能够实现hek293t活细胞染色，染色率接近100%。
29.3. 按照表1中的成分和用量配制单细胞分离体系(x=0.5)，而后利用数字pcr一体机(sniper公司dq-24型号)进行单细胞分离, 程序如表2所示。在明场和荧光场下对微液滴包裹细胞的情况进行观察，结果如图2所示，其中图2中标注为a的照片为明场观察结果，图2中标注为b为荧光场观察结果。通过图2可以看出，采用本发明提供的方法，能够实现利用全自动数字pcr一体机将单细胞包裹在微液滴中，从而成功实现单细胞的分离，每个微液滴中的细胞数为0或1。
30.表1 单细胞分离体系表2 单细胞分离程序实施例2：按照表1中的成分和用量配制单细胞分离体系，而后利用数字pcr一体机(sniper公司dq-24型号) 进行单细胞分离(分离程序参照表2), 并进行gadph扩增，扩增程序如表3所示,引物序列为5
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ctcctcctgttcgacagtca-3’；5
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cgaccaaatccgttgactcc-3’；探针序列为5
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fam-cgccagccgagccacatcgc-mgb-nfq-3’。采用全自动数字pcr一体机(sniper 公司dq-24型号)观察细胞的扩增情况，非细胞样本和1
×
pbs作为阴性对照。结果如图3所示，图3中标注为a/c/d的照片为hek293t细胞样本中gadph扩增情况。图3中标注为a的照片中，微液滴内清晰可见包裹的荧光点而非细胞样本没有，可能是细胞裂解不充分导致的，这些扩增后仍具形态的细胞散发出与其大小相近的荧光点。图3中标注为b的照片中为非细胞样本中gadph的扩增情况，微液滴均为高亮的液滴，未见细胞大小的荧光点。1
×
pbs扩增结果显示fam通道观察不到发光，不再给出照片。图3中标注为c的照片中所示的细胞充分裂解扩增并形成高亮液滴，标注为d的照片中显示通过全自动数字pcr一体机将该液滴识别为阳性信号。通过图3可以看出，采用本发明提供的方法，能够实现利用全自动数字pcr一体机监测到细胞目标基因的表达情况。
31.表3 扩增程序实施例3使用h-1975细胞重复实施例1，结果如图4和图5所示，图4显示细胞染色情况，其中图4中标注为a的照片为明场观察结果，图4中标注为b的照片为荧光场观察结果。表明该指示剂同样可使得h-1975发出绿色荧光,发光率接近100%。图5显示微液滴同样能够包裹住更大的h-1975细胞，且使得每个微液滴内还有0-1个细胞。其中图5中标注为a的照片为明场观察结果，图5中标注为b为荧光场观察结果。
32.实施例4使用h-1975细胞重复实施例2，检测t790m基因突变情况，检测t790m突变情况，引物序列为5
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atctgcctcacctccaccgt-3’；5
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tcccctccccgtatctccct-3’。探针序列为 5
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vic-atgagctgcgtgatgag-mgb-nfq-3’；5
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fam-atgagctgcatgatgag-mgb-nfq-3’。选择fam荧光通道进行检测。
33.结果如图6所示，图6中展示了h-1975细胞样本中t790m基因突变的扩增情况。图6中标注为a的照片中，含细胞的微液滴内清晰可见包裹的荧光点而不含细胞的没有荧光点。图6中标注为b的照片中为非细胞样本中t790m基因突变的扩增情况，微液滴均为高亮的液滴，未见细胞大小的荧光点。1
×
pbs扩增结果显示fam通道观察不到发光，不再给出照片。图6中标注为c的照片中所示的细胞充分裂解扩增并形成高亮液滴，标注为d的照片中显示通过全自动数字pcr一体机将该液滴识别为阳性信号。表明采用本发明提供的方法，能够实现利用全自动数字pcr一体机监测到细胞的基因突变情况。
34.通过实施例1-4可见，本发明的方法适用于多种细胞。
35.实施例5本实施例中，将经过活细胞染色和未经染色的hek293t细胞分别使用实施例1中的体系和程序进行单细胞分离。结果显示，经过染色的细胞可以通过数字pcr一体机的荧光通道检测到微液滴内包裹的荧光点(图7中标记为a的照片)，而未经染色的细胞则没有这种现象(图7中标记为b的照片)。
36.实施例5展示了只对部分细胞进行荧光染色的应用场景，在待测细胞含有多种细胞时，可以只对其中部分进行荧光染色，从而在统计时忽略检测者不关心的细胞类型。示例性的应用场景为：在人外周血中检测肿瘤细胞，可以使用特定荧光染料或者抗体偶联的荧
光染料标记肿瘤细胞，从而排除正常血细胞的干扰。在检测时，如果仅有血细胞，检测板上没有荧光点，可以直接停止检测，从而节省检测时间。
37.实施例6将100个经过染色的hek293t细胞和经过染色的h-1975细胞按照1:1的比例混合。
38.按照表1配置，引物探针序列参照实施例4，用于检测h-1975细胞特有的t790m基因突变。按照表2、3分离和扩增，观察高亮荧光点的数量。各检测板共计检测到含有细胞的微液滴（有荧光点）186个，裂解后仍有22个微液滴中的细胞维持细胞形态（仍有荧光点）。最终检测出fam荧光通道下高亮微液滴共计87个。按照传统方式计算，待测细胞中t790m基因突变率为87/200
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100%=43.5%，距离理论数值50%有较大偏差。
39.使用实际数出的细胞数修正结果后，t790m基因突变率为87/（186-22）
×
100%=53%，比修正前更接近理论数值。可见，在测试中出现检测细胞总量损失（可能原因是细胞粘附在容器或进样器、管道壁上，细胞数量越少越明显），以及细胞裂解率不理想的情况下，通过本发明的即时监控，获取各阶段的数值，仍然可以对检测结果进行修正，并提高检测的准确度。
40.采用本技术的方法，在需要从大量细胞中筛选特定的细胞时，可以快速识别出特定的细胞并进行计数，并且只针对特定的细胞进行测序。相比传统方法中只能扩增后检测统计阳性率，能够节约检测时间，更可以减少后期数据处理工作。