一种靶向降解突变蛋白的纳米受体的制备方法与应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向降解突变蛋白的纳米受体的制备方法与应用。

背景技术：

1、蛋白质稳态和质量控制对细胞的正常生命活动至关重要。蛋白质稳态异常和突变蛋白的积累是包括肿瘤在内的许多疾病的诱因。因此，诱导突变蛋白质的降解，降低突变蛋白质的水平可以有效治疗这些疾病。在众多策略中，使用蛋白水解靶向嵌合分子(protacs)促进靶蛋白通过蛋白酶体途径降解是一种很有应用前景的方法。但由于蛋白酶体本身腔体狭窄，导致单独通过蛋白酶体不能有效降解某些大分子量的致病蛋白或蛋白聚集体，这极大地限制了protacs在降解某些大分子量致病蛋白或聚集体方面的应用。

2、自噬作为真核细胞中蛋白质降解的一种有效途径，可以利用溶酶体系统清除大量潜在危险的蛋白质聚集体等。而且越来越多的证据表明，自噬在某些情况下对待降解物具有很高的选择性，这种现象被称为选择性自噬(selective autophagy)。其中，泛素系统和受体蛋白(receptor)是选择性自噬过程中的两个重要部分，受体蛋白可以识别并结合待降解物表面的泛素化信号，并将待降解物带到新出现的自噬体中，从而实现选择性自噬的特异性。

技术实现思路

1、基于选择性自噬的生物学原理，大多数情形下胞内蛋白若要通过选择性自噬进行降解，需要两个必要条件：一是细胞内有较高水平的自噬，产生足够多的自噬体或自噬溶酶体以确保待降解蛋白的充分降解；二是能特异性识别待降解物的受体蛋白需要被激活，将胞内待降解蛋白带到自噬体内降解。

2、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种靶向降解突变蛋白的纳米受体，通过模拟选择性自噬途径中的关键受体蛋白，特异性结合肿瘤细胞中的突变p53蛋白并介导其自噬途径降解。

3、本发明的另一目的在于提供上述的靶向降解突变蛋白的纳米受体的制备方法。

4、本发明的另一目的在于提供上述的靶向降解突变蛋白的纳米受体的应用。

5、本发明的再一目的在于提供一种肿瘤治疗药物。

6、本发明的目的通过下述技术方案实现：

7、一种纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)将马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸和阳离子脂质材料混匀；

9、(2)将步骤(1)制备的混合液滴入缓冲液中，搅拌后得到纳米颗粒。

10、步骤(1)所述的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸中聚乙二醇的分子量为1000～3000，聚乳酸的分子量为1000～3000；优选聚乙二醇的分子量为2000，聚乳酸的分子量为2000。

11、步骤(1)所述的阳离子脂质材料包括1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dotma)中的至少一种；优选为包括1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)。

12、步骤(1)所述的阳离子脂质材料的加入量为马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸质量的5～40％；优选为20％。

13、步骤(1)所述的混匀为溶于溶剂混合均匀；优选为溶于四氢呋喃(thf)混合均匀。

14、上述的制备方法中步骤(1)优选为：

15、将马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸、阳离子脂质材料和活性成分混匀。

16、上述的活性成分包括顺铂(cddp)、pt(iv)前药中的至少一种。

17、步骤(2)所述的缓冲液为pbs缓冲液；优选为ph＝7.4,0.01m的pbs缓冲液。

18、步骤(2)还包括以下步骤：

19、所得纳米颗粒经旋蒸除去溶剂，离心后取上清液，得到纯化后的纳米颗粒。

20、上述的离心的条件为2000～4000rpm/min下离心3～10min；优选为3000rpm/min下离心5min。

21、一种靶向降解突变蛋白的纳米受体，是在上述纳米颗粒表面修饰靶向突变蛋白的结合肽得到的靶向降解突变蛋白的纳米受体；

22、所述的突变蛋白包括突变p53蛋白；优选为包括s241f、r175h、r248w、r280k位点突变中的至少一种。

23、所述的结合肽为能够结合突变蛋白的结合肽；优选为靶向p53蛋白的结合肽mbp；进一步优选序列为gpvvprtqymslafgwc的结合肽mbp。

24、所述的p53蛋白的来源为包括es-2、mda-mb-231、mia paca-2和sk-br-3细胞中的至少一种。

25、上述靶向降解突变蛋白的纳米受体的制备方法，包括以下步骤：

26、将靶向突变蛋白的结合肽加入到纳米颗粒的溶液中，搅拌反应后得到靶向降解突变蛋白的纳米受体。

27、所述的靶向突变蛋白的结合肽的加入量与纳米颗粒的质量比为1～3:4；优选为5:12。

28、优选地，上述搅拌反应后，将反应物透析除去未反应的结合肽，再进行超滤和浓缩，获得纯化后的靶向降解突变蛋白的纳米受体；

29、所述的透析为将反应物转移至透析袋(mwco 14000da)中置于pbs溶液(ph值7.4，浓度0.01m)中透析。

30、上述靶向降解突变蛋白的纳米受体与突变蛋白有良好的结合性，其对正常细胞毒性低，能够诱导不同类型的突变蛋白降解，具有广谱性。

31、上述纳米颗粒及靶向突变蛋白的纳米受体在制备抗肿瘤药物中的应用。

32、一种肿瘤治疗药物，是在所述的靶向降解突变蛋白的纳米受体上负载具有治疗作用的活性成分得到的。

33、所述的活性成分包括顺铂(cddp)、pt(iv)前药中的至少一种。

34、上述肿瘤治疗药物的制备方法，包括以下步骤：

35、将马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸、阳离子脂质材料和活性成分混匀，滴入缓冲液中，第一次搅拌后得到纳米颗粒，再加入结合肽，第二次搅拌反应后得到肿瘤治疗药物。

36、优选地，所述第一次搅拌后，将反应物透析除去未反应的活性成分，第二次搅拌后，将反应物透析除去未反应的结合肽，再进行超滤和浓缩，获得纯化后的肿瘤治疗药物。

37、一种靶向降解突变蛋白的纳米受体，能够通过模拟选择性自噬受体靶向突变蛋白质，并诱导其进行降解。

38、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

39、本发明提供了一种靶向降解突变蛋白的纳米受体的制备方法与应用，本发明利用细胞自噬效应，通过模拟与突变p53蛋白相互作用的自噬受体，使突变p53聚集体被带到自噬体中并被降解，从而消除p53突变对肿瘤的影响。该“纳米受体”(nrs)体系由马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸(mal-peg-pla)和阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)通过纳米沉淀法制备形成纳米颗粒，并通过“巯基-马来酰亚胺”高效点击反应进一步在颗粒表面修饰上靶向突变p53蛋白的结合肽(mbp)得到。研究结果显示nrs可诱导多种突变类型的肿瘤细胞中突变p53蛋白降解，且该过程是一种自噬依赖和泛素化依赖的过程；nrs对突变p53的降解抑制了肿瘤细胞中突变p53的获得性功能(gof)，包括抑制了肿瘤细胞的增殖和迁移能力、增强了肿瘤细胞死亡以及增强肿瘤细胞对顺铂(cddp)的敏感性。最后，负载pt(iv)前药的nrs/pt在es-2卵巢癌模型和患者来源的异种移植(pdx)卵巢癌中都显示出良好的协同抗肿瘤效果。