一种大豆低聚糖相关的KASP标记及其应用

一种大豆低聚糖相关的kasp标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，尤其涉及一种大豆低聚糖相关的kasp标记及其应用。


背景技术：

2.大豆低聚糖是大豆子粒中可溶性糖类的总称，主要包括蔗糖、棉子糖、水苏糖。研究表明，低聚糖有很好的理化性质—安全无毒性、低甜度、热稳定性强等，并且，它有很重要的生理功能—防止腹泻、抗癌、保护肝脏功能等。因此，大豆低聚糖是一种保健食品，广泛应用于饮料、酸奶、水产制品、果酱、糕点和面包等食品中，具有广阔的市场。
3.虽然大豆低聚糖对人类健康和植物生长发育发挥着重要作用，但目前对大豆资源的利用程度较低，专用型大豆品种少，培育专用型大豆具有很好的发展前景。大豆低聚糖是典型的数量性状，受多基因控制，容易受到土壤环境，气候变化等外界环境因素的影响。在常规的筛选中，每个大豆种质的低聚糖都进行测定，存在鉴定周期长、成本高、费时费力的问题，不能满足稳定高效的筛选需求。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆低聚糖相关的kasp标记及其应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记包括s18_51868868t/g和s10_38081012t/c中的一种或两种，所述s18_51868868t/g为大豆基因组第18号染色体51868868bp位置上的碱基为t/g，所述s10_38081012t/c为大豆基因组第10号染色体38081012bp位置上的碱基为t/c。
7.优选的，所述s18_51868868t/g处碱基是t的大豆为棉子糖含量低的大豆，碱基是g的大豆为棉子糖含量高的大豆。
8.优选的，所述s10_38081012t/c碱基是t的大豆为水苏糖含量高的大豆，碱基是c的大豆为水苏糖含量低的大豆。
9.本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的引物对，所述kasp标记的引物对包括s18_51868868t/g引物对和s10_38081012t/c引物对中的一种或两种；
10.所述s18_51868868t/g的上游引物f1的序列如seq id no.1所示，上游引物f2的序列如seq id no.2所示，下游引物r的序列如seq id no.3所示；
11.所述s10_38081012t/c的上游引物f1的序列如seq id no.4所示，上游引物f2的序列如seq id no.5所示，下游引物r的序列如seq id no.6所示。
12.本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
13.本发明还提供了一种上述kasp标记、引物对或试剂盒在提高大豆低聚糖种质育种中的应用。
14.本发明还提供了一种筛选高低聚糖含量大豆的方法，包括如下步骤：
15.以待测大豆基因组dna为模板，利用上述的引物对分别进行pcr扩增反应，通过pcr扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
16.优选的，选择大豆基因组中第18号染色体51868868bp位置上的基因型为gg和/或大豆基因组中第10号染色体38081012bp位置上的基因型为tt，则待测大豆为高低聚糖含量大豆。
17.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
18.本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，本发明利用gwas分析低聚糖显著关联的snp位点，并设计得到2个kasp标记，本发明的s18_51868868t/g检测高棉子糖含量的准确率为91.3％，s10_38081012t/c检测高水苏糖含量的准确率为93.5％，故本发明的kasp标记可准确对棉子糖和水苏糖含量性状进行基因分型，通过基因分型发现基因型为gg的大豆种质的棉子糖含量高于tt的棉子糖含量，基因型为tt的大豆种质的水苏糖含量高于cc的水苏糖含量，因此，本发明的kasp标记能够用于大豆高低聚糖含量种质的选育，且本发明的kasp标记进行早期育种的选择，减少大豆育种工作量，加快大豆育种进程具有重要意义。
附图说明
19.图1为自然群体重测序结果，其中a为进化树，b为主成分分析，c为连锁不平衡分析；
20.图2为2020年及2021年两个环境大豆种质低聚糖全基因组关联分析曼哈顿图及q-q图，其中a、b、c分别是2020年水苏糖、棉子糖和蔗糖的gwas结果，d、e、f、分别是2021年水苏糖、棉子糖、蔗糖的gwas结果；
21.图3为kasp标记对不同大豆种质基因分型，其中a为棉子糖基因分型图，b为水苏糖基因分型图。
具体实施方式
22.本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记包括s18_51868868t/g和s10_38081012t/c中的一种或两种，所述s18_51868868t/g为大豆基因组第18号染色体51868868bp位置上的碱基为t/g，所述s10_38081012t/c为大豆基因组第10号染色体38081012bp位置上的碱基为t/c。
23.在本发明中，当所述kasp标记包括s18_51868868t/g和s10_38081012t/c中的一种或两种，均与大豆低聚糖含量相关。作为一优选的实施方式，本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为s18_51868868t/g，所述s18_51868868t/g为大豆基因组第18号染色体51868868bp位置上的碱基为t/g。作为另一优选的实施方式，本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为s10_38081012t/c，所述s10_38081012t/c为大豆基因组第10号染色体38081012bp位置上的碱基为t/c。作为又一优选的实施方式，本发明提供了一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为s18_51868868t/g和s10_38081012t/c，所述s18_51868868t/g为大豆基因组第18号染色体51868868bp位置上的碱基为t/g，所述s10_38081012t/c为大豆基因组第10号染色体38081012bp位置上的碱基为t/c。
24.在本发明中，所述s18_51868868t/g处碱基是t的大豆优选为棉子糖含量低的大
豆，碱基是g的大豆优选为棉子糖含量高的大豆；所述s10_38081012t/c碱基是t的大豆优选为水苏糖含量高的大豆，碱基是c的大豆优选为水苏糖含量低的大豆。
25.本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的引物对，所述kasp标记的引物对包括s18_51868868t/g引物对和s10_38081012t/c引物对中的一种或两种；
26.所述s18_51868868t/g的上游引物f1的序列如seq id no.1所示，上游引物f2的序列如seq id no.2所示，下游引物r的序列如seq id no.3所示；
27.所述s10_38081012t/c的上游引物f1的序列如seq id no.4所示，上游引物f2的序列如seq id no.5所示，下游引物r的序列如seq id no.6所示。
28.在本发明中，所述kasp标记的引物对包括s18_51868868t/g引物对和s10_38081012t/c引物对中的一种或两种。作为一优选的实施方式，本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的引物对，所述kasp标记的引物对为s18_51868868t/g引物对；所述s18_51868868t/g的上游引物f1的序列如seq id no.1所示，上游引物f2的序列如seq id no.2所示，下游引物r的序列如seq id no.3所示。作为另一优选的实施方式，本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的引物对，所述kasp标记的引物对为s10_38081012t/c引物对；所述s10_38081012t/c的上游引物f1的序列如seq id no.4所示，上游引物f2的序列如seq id no.5所示，下游引物r的序列如seq id no.6所示。作为又一优选的实施方式，本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的引物对，所述kasp标记的引物对为s18_51868868t/g引物对和s10_38081012t/c引物对；所述s18_51868868t/g的上游引物f1的序列如seq id no.1所示，上游引物f2的序列如seq id no.2所示，下游引物r的序列如seq id no.3所示；所述s10_38081012t/c的上游引物f1的序列如seq id no.4所示，上游引物f2的序列如seq id no.5所示，下游引物r的序列如seq id no.6所示。
29.本发明还提供了一种用于检测上述kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
30.在本发明中，所述试剂盒优选的包括pcr扩增反应液，进一步优选的，所述pcr扩增反应液包括s18_51868868t/g引物对和s10_38081012t/c引物对中的一种或两种。所述pcr扩增反应液还优选的包括大豆样品dna模板和2
×
kasp mastermix。
31.本发明还提供了一种上述kasp标记、引物对或试剂盒在提高大豆低聚糖种质育种中的应用。
32.本发明还提供了一种筛选高低聚糖含量大豆的方法，包括如下步骤：
33.以待测大豆基因组dna为模板，利用上述的引物对分别进行pcr扩增反应，通过pcr扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
34.在本发明中，选择大豆基因组中第18号染色体51868868bp位置上的基因型为gg和/或大豆基因组中第10号染色体38081012bp位置上的基因型为tt，则待测大豆为高低聚糖含量大豆。选择大豆基因中第18号染色体51868868bp位置上的基因型为tt和/或大豆基因组中第10号染色体38081012bp位置上的基因型为cc，则待测大豆为低低聚糖含量大豆。
35.在本发明中，选择大豆基因组中第18号染色体51868868bp位置上的基因型为gg，则待测大豆为高棉子糖含量大豆，基因型为tt，则待测大豆为低棉子糖含量大豆，基因型为gg的大豆种质的棉子糖含量高于tt的棉子糖含量，含量平均提高18.87％％～26.20％。选择大豆基因组中第10号染色体38081012bp位置上的基因型为tt，则待测大豆为高水苏糖含
量大豆，基因型为cc，则待测大豆为低水苏糖含量大豆，基因型为tt的大豆种质的水苏糖含量高于cc的水苏糖含量，含量平均提高21.89％～24.05％。在本发明中，本发明通过选择大豆基因组中第18号染色体51868868bp位置上的基因型为gg和大豆基因组中第10号染色体38081012bp位置上的基因型为tt，则待测大豆的低聚糖含量显著提高。
36.在本发明中，以待测大豆基因组dna为模板，利用上述的引物对分别进行pcr扩增反应。所述pcr扩增体系优选的包括20～30ng/μl大豆样品dna模板5μl，2
×
kaspmastermix 5μl，kaspassaymix(f1:f2:r＝1:1:1)0.14μl。所述pcr反应条件为94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃～55℃退火60s(每个循环以0.6℃下降)，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环。
37.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.(1)关联群体：选出来自全国各地的具有代表性的264份大豆，包含52份地方种和212份栽培种，另外收集野生豆19份，组成了微核心种质资源，共283份，大豆材料主要来自黄淮海地区和中国南方生态区，少部分来自中国北方生态区。
40.(2)重测序：对283份材料进行重测序，平均测序深度为12.4
×
，获得snp标记10210329个，基于3319306个高质量snp构建了大豆系统发育树，可以有效地将野生大豆、地方品种和改良品种区分开来，其中地方种和改良品种从野生大豆进化、人工选择而来(图1中的a)；主成分分析(图1中的b)表明野生大豆能够有效地同地方种和改良种区分开来，地方种和改良品种更为接近，野生大豆和非野生大豆之间存在较大差异。连锁不平衡(ld)分析表明(图1中的c)，所有材料的ld值约为106kb，野生大豆的ld值约为33kb，而非野生大豆材料的ld值约为120kb。
41.(3)低聚糖gwas分析：用于全基因组关联分析自然群体的snp标记来自重测序工作，该高密度物理图谱共包含2597425个snp。全基因组关联分析采用基于r软件的gapit算法包进行计算，采用混合线性模型(mlm)进行全基因组关联分析以控制假阳性关联位点。以p≤1/2597425＝3.85
×
10-7
，-logp≥6.4作为显著阈值，当snp的-logp≥6.4时，则被认为是显著关联位点，而当snp的阈值处于5≤-logp＜6.4时，则被认为是潜在关联位点。
42.用高效液相色谱法分别检测了2020年收获于海南基地和2021年收获与南京六合基地的大豆自然群体的低聚糖含量，对两年的低聚糖含量表型数据进行全基因组关联分析(见图2)。
43.表1自然群体中与大豆低聚糖关联的snp位点数量
44.[0045][0046]
由表1可知，两年共关联到871个关联snp。
[0047]
由图2可知，2020年共关联到613个snp位点，与棉子糖关联的snp有83个其中位于5号染色体上的snp有5个，11号染色体1个、13号染色体2个、18号染色体上的snp有75个，单个snp的表型变异解释率在6.56％～8.10％之间；与水苏糖关联的snp有526个，其中位于10号染色体上的snp有502个，11号、14号、16号染色体上snp各有1个，20号染色体上的snp有21个，单个snp位点的表型变异解释率在8,74％～12.53％之间；与蔗糖关联的snp有4个分别位于4号、8号、12号、18号染色体上，单个snp位点的表型变异解释率在7.73％～7.98％之间。
[0048]
2021年共关联到258个snp，检测到与棉子糖关联的snp有224个其中位于5号有3个、7号有2个、9号染色体上的snp最多，有211个，10号染色体有5个。单个snp位点的表型变异解释率为20.47％～21.18％；与水苏糖关联的snp有9个大多分布在11、19号染色体上，单个snp位点的表型变异解释率为98.13％，与蔗糖关联的snp有25个大多分布在2、8、12、20号染色体上，单个snp位点的表型变异解释率为62.19％～63.13％。各低聚糖组分显著相关的snps(见表2)。
[0049]
部分显著snp位点在两年环境中均能检测到，在5、13、18号染色体上共同定位到与棉子糖关联snp，在11号染色体上共同定位到与水苏糖关联的snp。
[0050]
表2各低聚糖组分显著相关的snps
[0051]
[0052][0053]
实施例2
[0054]
一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为实施例1得到的显著关联snp位点s18_51868868(t/g)和s10_38081012(t/c)。
[0055]
分别设计三个引物，上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，其中f1和f2分别包括fam、vic荧光接头序列(下划线)，序列如表3所示：
[0056]
表3kasp标记的特异性引物
[0057]
[0058][0059]
实施例3
[0060]
一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为实施例1得到的显著关联snp位点s18_51868868(t/g)，分别设计三个引物，上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，分别为seq id no.1、seq id no.2、seqid no.3所示的序列。
[0061]
实施例4
[0062]
一种大豆低聚糖相关的kasp标记，所述kasp标记为实施例1得到的显著关联snp位点s10_38081012(t/c)。
[0063]
分别设计三个引物，上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，分别为seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示的序列。
[0064]
实施例5
[0065]
一种用于s18_51868868(t/g)kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包括s18_51868868(t/g)上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，分别为seqid no.1、seq id no.2、seq id no.3所示的序列。
[0066]
实施例6
[0067]
一种用于s10_38081012(t/c)kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包括s10_38081012(t/c)上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，分别为seqid no.4、seq id no.5、seq id no.6所示的序列。
[0068]
实施例7
[0069]
一种用于s18_51868868(t/g)和s10_38081012(t/c)kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包括s18_51868868(t/g)和s10_38081012(t/c)上游引物f1、上游引物f2和下游引物r，分别为seq id no.1～seq id no.6所示的序列。
[0070]
实施例8
[0071]
一种筛选高低聚糖含量大豆的方法，步骤如下：
[0072]
(1)提取待测大豆的dna：取大豆的嫩叶，将小钢球放入2ml离心管中，迅速放入液氮中保存。将离心管放在植物组织研磨机上(30hz、40s)研磨粉碎，加入预热好的ctab 600μl迅速混匀，65℃水浴30min不时摇晃；加入等量的24:1(氯仿：异戊醇)，轻轻倒置，12000r 5min，吸取上清液，再次提取。加入100μl 5m nacl溶液和等量的异丙醇(预冷)，轻轻摇动，放入冰箱30分钟；12000r 5min倒掉废液，加入600μl 70％酒精将沉淀弹起，离心重复一次，最后加入20μl ddh2o，放置冰箱保存。
[0073]
(2)针对与大豆低聚糖显著关联的snp位点s18_51868868(t/g)和s10_38081012(t/c)开发kasp标记，标记序列如表3所示，以步骤(1)提取得到大豆基因组的dna为模板，用
相应的引物f1、f2、r分别进行pcr扩增，反应在quantstudio5实时荧光定量pcr仪中进行，得到pcr扩增产物，其中扩增体系为：大豆样品dna模板5μl(25ng/μl)，2
×
kaspmaster mix 5μl，kaspassay mix(f1:f2:r＝1:1:1)0.14μl，pcr反应条件见表4。
[0074]
(3)反应结束后，在quantstudio5实时荧光定量pcr仪读取反应产物的荧光数据，利用表3所述的kasp分子标记引物对在实时荧光定量pcr仪上对40份大豆进行扩增并进行基因分型。
[0075]
表4pcr反应条件
[0076][0077]
表5不同基因型大豆种质的低聚糖含量
[0078][0079]
图3和表5结果表明：s18_51868868(t/g)分子标记引物可以清楚地分开这两种基因型，y轴附近的蓝色圆点为携带g等位变异位点的高棉子糖含量的大豆种质，x轴附近的红色圆点为携带t等位变异位点的棉子糖含量低的大豆种质(图3中的a)，基因型为gg的大豆种质的棉子糖含量一般要高于tt的棉子糖含量，含量平均提高18.87％％～26.20％。s10_38081012(t/c)分子标记引物可以清楚地将两种基因型分开，y轴附近的蓝色圆点为携带t等位变异位点的高水苏糖含量的大豆种质，x轴附近的红色圆点为携带c等位变异位点的水苏糖含量低的大豆种质(图3中的b)，基因型为tt的大豆种质的水苏糖含量一般要高于cc的水苏糖含量，含量平均提高21.89％～24.05％。本发明的s18_51868868t/g检测高棉子糖含量的准确率为91.3％，s10_38081012t/c检测高水苏糖含量的准确率为93.5％，两个标记检测大豆低聚糖含量效果理想。
[0080]
本发明通过三亚地区和南京地区两个不同环境试验，对不同环境条件下大豆群体的低聚糖含量进行测定，并进行全基因组关联分析，这使关联分析得到的低聚糖snp位点更
加可靠，低聚糖候选基因的发掘和遗传标记的开发更加精确。本发明设计开发的2个kasp标记，通过基因分型发现基因型为gg的大豆种质的棉子糖含量高于tt的棉子糖含量，基因型为tt的大豆种质的水苏糖含量高于cc的水苏糖含量，两个kasp分子标记能够用于大豆低聚糖种质的选育。因此，本发明可准确对棉子糖和水苏糖含量性状进行基因分型，该分子标记可应用于早期大范围的种质筛选，辅助功能性大豆分子育种。
[0081]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。