中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)尿液检测试剂盒的制作方法

本技术涉及生物检测领域，具体的涉及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)尿液检测试剂盒。

背景技术：

1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)是lipocalin的一种，最初是在激活中性粒细胞中被发现的一种小分子量分泌性蛋白，现代研究表明，ngal是诊断急性肾损伤的最有效生物学标志之一，也是早期糖尿病肾病的有效标志物之一。ngal具有强大的功能，除了作为载脂家族成员具有结合并运输疏水性小分子的功能外，还与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展过程相关。ngal可消炎、抗炎，可促进肾脏祖细胞向早期肾小管上皮细胞分化，可修复n-钙黏蛋白，上调保护酶血红素加氧酶和抑制细胞死亡。

2、研究发现，慢性肾病ckd患者的血清、尿ngal水平显著高于正常人群，并与肾小球滤过率(gfr)呈密切负相关，而scr与gfr的关联程度不及ngal。因此，ckd患者ngal水平不仅是优于scr反映cfr下降的指标，更是评价ckd患者肾脏损伤程度的标志物。但ckd患者尿ngal增高幅度不及aki患者，可能与受到其他慢性疾病因素的干扰有关。欧洲一项ckd成年患者队列研究发现，血清ngal＞435ng/ml或尿ngal＞231ng/ml的患者更早达到随访终点事件；并且血清、尿液ngal浓度每增高10ng/ml，ckd进展的风险分别提高了3％与2％，经多变量cox比例风险回归模型分析，血清、尿ngal是ckd的进展风险的独立预测因子。

3、ngal已经被证实是急性肾损伤的标志物。早期诊断急性肾功能损伤(aki)时血、尿ngal浓度通常会迅速升高，2h最为明显(比临界值升高几十至几百倍)，血清肌酐(scr)、尿酶等传统指标往往要在24～72h才后明显升高，因而ngal可用于aki的早期诊断。mishra等在体外循环术并发aki患儿的队列研究中发现，2h尿ngal诊断aki的aucroc为0.998，其临界值为50μg/l(elisa法)时，敏感性、特异性分别为100％、98％，而血清ngal诊断aki的aucroc为0.906，其临界值为25μg/l时，敏感性、特异性为70％、94％；多元回归分析显示，2h尿ngal水平是预测aki的强有力预测因子。也发现成年患者2h尿、血清ngal水平是诊断aki的可靠的早期诊断指标。meta分析表明，ngal对aki的诊断效能受到标本类型、年龄、检测方法等因素影响，但ngal对儿童aki的诊断效能优于成年人，可能是成年人受到其他慢性疾病等因素影响。值得注意的是，脓毒血症等危重疾病患者，因受到炎症反应等因素影响，ngal可能并不适用于aki的早期诊断，诊断特异性欠佳。北美地区研究发现，143名全身炎症反应综合征及脓毒性休克患儿入院后24h内，血清ngal诊断aki的aucroc为0.677，在临界值为139ng/ml时，敏感性为86％，特异性仅为39％。经多变量分析后发现，血ngal并不是发生aki事件的预测指标。在成人患者研究中也得到类似结论。另有研究表明，危重患儿48h内尿液ngal水平可以准确预测aki的发生(aucroc为0.79)。但当scr升高后，aucroc降至0.63。icu中的aki成人患者血浆ngal水平在48h后与正常对照组亦无显著性差异。尿ngal可作为脓毒血症后并发aki的早期诊断标志物，准确性达0.968，这可能与种族间水平差异有关。

4、近年来ngal基因的功能越来越受到人们的重视。研究表明ngal与细菌感染性或非细菌性感染性疾病、一些慢性炎症、肿瘤的侵袭与转移以及与肿瘤细胞的调节与分化关系密切。而且ngal与炎症的研究结果表明，ngal在这些疾病中的表达特征趋于成熟，极有可能成为多种临床炎症相关性疾病诊断的标志物，同时ngal在肿瘤的侵袭转移过程的功能与机制也趋于明朗，而ngal与肿瘤细胞的调节和分化成为人们讨论的热点与研究的转折点。ngal在多种肿瘤的发生及发展过程中发挥重要功能，是一种新的癌基因。研究发现，宫颈癌中ngal的表达明显升高，与其发生及转移相关。ngal在宫颈癌中相对于癌旁组织表达升高，甲状腺癌中抑制ngal基因的表达可降低癌细胞的迁移和侵袭，而过表达可促进癌细胞的迁移和侵袭，ngal表达的抑制后宫颈癌细胞增殖显著降低，凋亡增加。

5、基于ngal作为标记的重要性，开发检测ngal的检测试剂盒是研究的重要方向。生理情况下，ngal在体内的一些器官的表达很低，包括肾脏、癌组织在内。因此，检测的敏感性要求很高。现有技术已有根据ngal基因序列，设计并合成pcr引物，将pcr扩增的特异片段克隆入t载体，重组质粒经筛选、鉴定、定量后作为标准品。在上述ngal扩增片段内部设计fq-pcr引物，通过正交设计方式对pcr引物浓度、退火温度、sybr greeni染料浓度等pcr反应条件进行优化，从而建立ngal的检测方法。但是现有技术的方法主要是pcr的方法，对于仪器设备的要求比较高，而且检测不便利，急需一种可以便利化、不需要仪器即可检测的新方法。

技术实现思路

1、本发明根据现有技术的缺陷，提供了一种改进的方法。

2、一方面，针对ngal，提供了特异性的单克隆抗体。

3、具体的，所述单克隆抗体为n-3a4，其轻链可变区的序列为seq id no：1和重链可变区的序列seq id no：2。

4、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区和重链可变区中进行一个或二个或多个的保守氨基酸的突变，突变后的抗体仍然保持相应的抗体的活性。

5、进一步的，在捕捉目标蛋白时，可适宜地使用本发明的单克隆抗体。例如，将本发明的单克隆抗体生物素化并与外来体反应后，可通过使用链霉亲和素固相磁性珠进行分离。

6、更详细而言，首先依照公知的方法将本发明的单克隆抗体或其抗体片段生物素化。接着，将待检测蛋白与生物素化抗体混合，在4℃过夜反应。然后，添加链霉亲和素固相磁性珠，在4℃进一步反应2小时后，使用磁铁进行分离，可以回收结合于生物素化抗体的靶标蛋白。

7、具体地，使来源于受试者的机体试样与本发明的单克隆抗体或其抗体片段接触，依照前述蛋白的捕捉分离法分离靶标蛋白。

8、应予说明，在本说明书中，机体试样只要是选自血液、血清、和血浆的机体试样，则没有特别限定。(免疫测定法)使用本发明的单克隆抗体的套件进行免疫测定。作为免疫测定法，可举出：酶免疫测定法(eia)、酶免疫测定法(elisa)、荧光免疫测定法(fia)、放射线免疫测定法(ria)、发光免疫测定法、免疫印迹法、蛋白质印迹法等，从能够简便且灵敏度良好地检测抗体的角度出发，优选elisa法。

9、elisa法中可举出：通常的竞争法、夹心法等，由于可将本发明的单克隆抗体或其抗体片段用于夹心法中的固相抗体、或固相抗体和标记抗体两者，因而优选夹心法。接着，示出夹心elisa法的一个方式。首先，使本发明的单克隆抗体或其抗体片段固相化，然后与含有外来体的被测试样接触，形成复合体。之后，对其添加将本发明的套件中的另一本发明的单克隆抗体或其抗体片段、疾病特异性蛋白抗体或其抗体片段分别进行了修饰的标记抗体，形成进一步的复合体，并检测标记，由此可分别测定来自试样中所含的外来体的信号量、试样中所含的疾病特异性蛋白量。因此，本发明还提供测定蛋白的存在量的方法，该方法包括使来源于受试者的机体试样与本发明的单克隆抗体的套件中所含的单克隆抗体接触而形成该复合体。

10、应予说明，在将本发明的单克隆抗体或其抗体片段固相化时，可以直接进行固相化，也可以经由公知的介质，例如，链霉亲和素来进行固相化。

11、本发明的单克隆抗体或者试剂盒可以用检测肾病或者癌症。

12、具体的癌症为“癌症”和“肿瘤”用于本文中时意指或描述哺乳动物中的生理学病症，其典型特征在于失控的细胞生长。癌症或肿瘤的实例包括，但不仅限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤(包括成神经管细胞瘤和成视网膜细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括良性肿瘤、促胃液素瘤、和岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤、和白血病或淋巴恶性肿瘤。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺瘤和肺鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃(gastric)或胃(stomach)癌包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾(kidney)或肾(renal)癌，前列腺癌，阴道癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食管癌，胆管肿瘤，以及头颈癌。优选地，所述癌症是实体瘤。术语“实体瘤”在用于本文中时指选自胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾(kidney)或肾(renal)癌，前列腺癌，阴道癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食管癌，胆管肿瘤，以及头颈癌的组的肿瘤。

13、进一步的，本发明还提供了一种检测用的试剂盒，所述试剂盒含有本发明的单克隆抗体。

14、进一步的，本发明提供一种检测试纸条。

15、所述的试纸条是免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻璃纤维，吸收垫用吸水滤纸。羊抗鼠多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带；单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带，参数0.1μl/mm划线，指控带与检测带间距约为7mm。划线后，将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中孵育。将吸收垫、样品垫及结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度4mm/条，干燥避光保存。

16、有益效果

17、与现有技术相比本发明具有如下优点：

18、本发明针对ngal蛋白提供了特异性的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性以及结合活性。将所述抗体用于提供对肾损伤患者的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(15～20分钟)，检测样品范围大的特点；本发明的检测方法不需要任何特殊仪器、设备，具有检测成本低的特点；本发明的检测试剂盒操作简便，不需由专业人员操作；本发明的试剂盒储存方便，具有较好的应用前景。