一种褐藻胶裂解酶的基因、重组细胞、其构建方法及应用

1.本发明涉及一种褐藻胶裂解酶的基因、重组细胞、其构建方法及应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.在海洋中，褐藻是最为丰富的藻类资源，一直以来褐藻几乎都是作为饲料用于农牧饲渔方面，产品附加值低。近年来关于褐藻深加工和生物能源的研究不断深入，褐藻的加工产品褐藻胶、褐藻寡糖等在医药行业、食品行业、化妆品行业有了重要用途。
3.褐藻作为海洋上丰富的生物质资源，其主要成分是褐藻胶，其褐藻胶含量可达褐藻干重的40％，在可再生碳水化合物中排名第二。随着沿海经济的发展，海带养殖业的崛起，我国的褐藻胶产量现在居世界首位。
4.褐藻胶经过物理法、化学法和酶降解法可以得到的聚合度在20以下的小分子糖链片段，称为褐藻寡糖。褐藻寡糖相比于褐藻胶有更明显的活性优势，摒弃了褐藻胶不能穿过有机体的生物膜的缺点，所以逐渐成为研究热点。褐藻寡糖具有促进生长、增强抗病能力、提高免疫能力、抗炎消炎的作用，这些优势使其在农业生产、食品加工还有医药领域拥有广泛的应用价值。
5.褐藻寡糖的生产通常采用物理降解法，化学降解法和生物降解法，物理法虽然快速但是成本高，化学法虽然简单便捷但是污染严重，应用范围受限，与之相比较，生物酶解法则反应温和，成本低廉，产生的褐藻寡糖无副作用，所以前景广阔，但是受限于如何找到一种合适的高效的且能大规模生产的褐藻胶裂解酶。为了获得优质褐藻寡糖，需要选择污染小、安全性高、绿色的降解途径，而酶降解法既没有物理法的高成本，又没有化学法的高污染、高毒害，具有反应条件温和、对底物专一性高、无污染等优点，而且还可以根据底物特异性生产特定的褐藻寡糖，又因其安全绿色，其产物还可以用于食品的加工。所以寻求一种高效的褐藻胶裂解酶显得尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明针上述现有技术的缺陷，提供一种褐藻胶裂解酶的基因、重组细胞、其构建方法及应用。
7.本发明的目的之一在于提供一种褐藻胶裂解酶的基因，其碱基序列为seq id no.1所示。
8.本发明的目的之二在于提供一种褐藻胶裂解酶基因的重组细胞，所述重组细胞为重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62，所述重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：cctcc no：m 2022537，分类命名为：大肠杆菌bl21/pet28a-alg62 escherichia coli bl21/pet28a-alg62。
9.本发明的目的之三在于提供一种上述重组细胞的构建方法，将上述基因转入重组
大肠杆菌质粒e.coli jm109/pet28a(+)中，得到重组质粒pet28a-alg62,其中质粒e.coli jm109/pet28a(+)的基因编号：genbank:agv20271.1，序列为seq id no.2所示，将重组质粒pet28a-alg62转入大肠杆菌e.coli bl21中，得到重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62。
10.进一步，其具体步骤包括：
11.(1)褐藻胶裂解酶的基因的合成：
12.在ncbi数据库中检索该种属全基因组序列并进行分析，获得该菌株中的褐藻胶裂解酶编码基因alg62，同时确定该基因的完整序列；对该序列进行酶切位点分析，结合pet-28a(+)上多克隆位点区域选择酶切位点，设计引物，根据引物od值，合成目标基因，于-20℃储存备用；
13.(2)质粒pet28a(+)的提取：
14.将e.coli jm109/pet28a(+)划线培养，挑取单菌落接种到液体lb培养基中培养；离心收集菌体，提取质粒pet28a(+)；
15.(3)重组质粒pet28a-alg62的构建：
16.将pcr产物和质粒pet28a(+)进行双酶切，二者用相同的限制性内切酶同时切割目的基因和质粒pet28a(+)，使之产生相同的粘性末端；混合均匀，置于干式恒温器中进行酶切；酶切产物纯化回收；
17.(4)e.coli bl21感受态细胞的制备及转化：
18.通过处理细胞使e.coli bl21细胞的通透性变大，便于外源基因载体进入感受态细胞；
19.(5)重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62的构建：
20.提取重组质粒pet28a-alg62，导入到e.coli bl21感受态细胞中，构建重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62菌株；进行双酶切验证，验证成功后，利用甘油管菌株保藏于-80℃冰箱中。
21.本发明的重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62菌株已提交生物保藏。
22.【生物保藏材料说明】
23.保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
24.保藏地址：中国武汉武汉大学；
25.保藏日期：2022年5月3日；
26.保藏编号：cctcc no：m 2022537；
27.分类命名：大肠杆菌bl21/pet28a-alg62 escherichia coli bl21/pet28a-alg62。
28.进一步，所述步骤(1)中，选择bamhⅰ酶切位点和xhoⅰ酶切位点，其中，上游引物5’端为bamhⅰ酶切位点，下游引物5’端为xhoⅰ酶切位点。
29.进一步，所述步骤(1)中，设计引物：
30.alg62f：5
’‑
cgcggatccgattacatgaagcatat-3’bamhⅰ31.alg62r：5
’‑
ccgctcgagaactagccttggtacttac-3’xhoⅰ32.其中，单下划线部分为酶切位点。
33.进一步，所述步骤(5)中，利用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切验证。
34.本发明的目的之四在于提供一种褐藻胶裂解酶的应用，主要应用于裂解褐藻胶制
备褐藻寡糖。
35.本发明的优点在于：重组菌株产酶方式温和、绿色、环保、高效；发酵条件稳定，发酵周期短，在工业化生产方面可以节约大量成本；酶活效率较高。
附图说明
36.图1为重组质粒pet28a-alg62构建过程；
37.图2为目的基因alg62的扩增图；
38.图3为反应温度对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；
39.图4为重组褐藻胶裂解酶的热稳定性；
40.图5为在不同缓冲液中，ph对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；
41.图6为ph对重组褐藻胶裂解酶酶活的稳定性；
42.图7为金属离子及化学试剂对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；
43.图8为重组质粒pet28a-alg62验证图；
44.图9为菌落pcr验证图；
45.图10为sds-page分析；
46.图11为诱导温度对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；
47.图12为诱导剂添加浓度对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；
48.图13为诱导时长对重组褐藻胶裂解酶酶活的影响；。
具体实施方式
49.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
50.本发明以筛选的一株野生型产褐藻胶裂解酶菌株为出发菌株，对其进行分子生物学鉴定，确定其种属为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus atcc 17749)，并应用现代基因工程手段，对产褐藻胶裂解酶编码基因进行基因克隆并转入宿主大肠杆菌细胞中，构建该酶的大肠杆菌异源表达系统，优化诱导方式和条件，为以后大规模发酵生产褐藻胶裂解酶打下基础，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的方法。
51.为了实现上述目的，本实施例采用如下的技术方案：
52.通过透明圈实验得到一株产褐藻胶裂解酶的野生型菌株，对其进行16s rdna测序分析，序列比对后确定该野生型菌株属于溶藻弧菌属(vibrio alginolyticus atcc 17749)。借助ncbi数据库对溶藻弧菌的基因组序列进行分析，查找得到该菌株上的一段褐藻胶裂解酶编码基因，其核苷酸长度为1566bp，编码521个氨基酸。通过限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ对该序列进行双酶切并与大肠杆菌表达载体pet-28a(+)相连接，成功构建了重组表达载体pet28a-alg62，将重组载体转化到大肠杆菌e.coli bl21中，构建重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62菌株，之后对其iptg诱导表达，可以得到可溶性褐藻胶裂解酶。
53.下面结合具体实施案例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
54.1)产褐藻胶裂解酶菌株的筛选
55.以铜藻为底物，加入无菌水，置于培养箱中使之腐烂，取腐烂液置于以海藻酸钠为底物的富集培养基中，于30℃培养箱中进行培养48h，将培养之后的菌悬液按照10、100、
1000倍稀释涂布于筛选培养基中，30℃恒温培养24h后，记录平板上的单菌落。将得到的单菌落点接到新的筛选培养基中，30℃培养，有透明圈产生，证明菌株具有降解褐藻胶的能力，将获得的单菌落保存于甘油管中。
56.2)菌株的鉴定
57.根据透明圈选择一株降解褐藻胶能力较强的菌株，将其在lb培养基上划线培养，37℃培养8-12h。在平板上挑取单菌落转接入lb液体培养基中，37℃过夜培养，接下来提取细菌基因组dna：取细菌培养液1.5ml，10000r/min离心1min，弃取上清，加入破壁缓冲液200μl进行悬浮，加入20μl蛋白酶k混匀，加入220μl缓冲液70℃放置10min，加入220μl无水乙醇，之后转移到新的吸附柱中12000r/min离心1min，漂洗液洗涤2次，最后用ddh2o洗脱到新的离心管中，-20℃备用。
58.以提取的基因组为模板，通用引物为27f和1492r进行pcr扩增，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，参见图2，之后将pcr产物经16s rdna测序比对分析，确定该菌株种属属于溶藻弧菌属(vibrio alginolyticus atcc 17749)。
59.3)褐藻胶裂解酶基因的合成
60.在ncbi数据库中检索该种属全基因组序列并进行分析，获得该菌株中的褐藻胶裂解酶编码基因，同时确定该基因的完整序列。对该序列进行neb cutter(http://nc2.neb.com/nebcutter2/)酶切位点分析，结合pet-28a(+)上多克隆位点区域选择bamhⅰ酶切位点和xhoⅰ酶切位点，上游引物5’端为bamhⅰ酶切位点，下游引物5’端为xhoⅰ酶切位点，设计引物：
61.alg62f：5
’‑
cgcggatccgattacatgaagcatat-3’bamhⅰ62.alg62r：5
’‑
ccgctcgagaactagccttggtacttac-3’xhoⅰ63.其中，单下划线部分为酶切位点；
64.引物交付于苏州金唯智生物科技有限公司合成，根据引物od值，用无菌水将其稀释成20mmol/l，于-20℃储存备用。
65.将e.coli jm109/pet28a(+)接种含有卡那霉素的培养基上划线培养，挑取单菌落接种到液体lb培养基中37℃，200r/min培养8h。离心收集菌体，根据质粒小提试剂盒说明进行质粒提取，最后将基因用60℃的无菌水洗脱到新的离心管中。
66.4)重组质粒pet28a-alg62的构建
67.将pcr产物和质粒pet28a(+)进行双酶切，用相同的限制性内切酶同时切割目的基因和质粒pet28a(+)，使之产生相同的粘性末端。在20ul反应体系中混合均匀，置于37℃的干式恒温器中酶切30min。酶切产物用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化回收。
68.本发明的重组质粒pet28a-alg62构建过程示意图如图1所示。
69.质粒dna单酶切之后使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，参见图8，注：m，10kb dna marker；1，重组质粒pet28a-alg62单酶切产物；2，空质粒pet28a(+)单酶切产物。
70.将目的基因与质粒纯化之后进行双酶切，连接之后热激法转入e.coli jm109中，挑取单菌落重新抽提质粒，单酶切验证，如图8所示，最左侧为10000marker，从左侧开始第一泳道基因大小在7000bp左右，符合目的基因连接上质粒大小，第二泳道为质粒空载体大小为5369bp，说明第一泳道质粒已经完成重组，目的基因已经克隆在pet28a(+)上。
71.将验证完成后的重组质粒pet28a-alg62再转化到e.coli bl21中，在含有卡那霉
素的lb培养基里培养。
72.5)感受态细胞的制备及转化
73.感受态细胞制备的原理：通过处理细胞使细胞的通透性变大，便于外源基因载体进入感受态细胞。因细胞膜的流动性，通透性逐渐被恢复。制备e.coli bl21感受态细胞及转化具体步骤如下：
74.1、将e.coli bl21在lb培养基上划线培养；
75.2、取1环单菌落接种于5ml液体lb培养基中，200r/min，37℃培养过夜；
76.3、按照初始od
600
＝0.02的接种量接入50ml/250ml的lb培养基中，37℃，200r/min培养，当菌体稍变浑浊测其od
600
值，直到od
600
到0.4时，停止培养，取1ml菌体于离心管中，冰浴放置10min，然后4℃，4000r/min离心10min收集菌体；
77.4、弃取上清，加入1ml预冷的0.1mol/l的氯化钙溶液重悬菌体，轻轻混匀，冰浴15min；
78.5、4℃，4000r/min，离心15min，收集菌体，弃上清，然后加入200μl预冷的0.1mol/l的氯化钙溶液(含有10％的甘油)重悬，轻轻混匀，保存于-80℃冰箱中；
79.6、从-80℃冰箱中取出冻存的感受态细胞，置于冰水浴中，将重组质粒pet28a-alg62加入其中，冰浴30min；
80.7、在42℃温水浴中放置90s热激，迅速转移至冰水浴中冷却5min；
81.8、加入1ml的无菌lb培养基，37℃，100r/min培养1h；
82.9、将菌液离心收集菌体，弃取部分上清，剩余100μl浓缩菌液，然后重悬涂布含有卡那霉素的lb平板上，37℃过夜培养，观察菌落生长情况，挑取单菌落进行液体扩大培养，并进行琼脂糖凝胶电泳验证。
83.参见图9菌落pcr验证图，注：m，2000dna marker；1，目的基因alg62；2，原始目的基因对照。
84.将验证正确的重组质粒转化e.coli bl21后划线培养挑取单菌落进行液体培养，之后对其进行菌落pcr验证，从图9中可知左侧1，2泳道条带大小与目的基因大小(1566bp)接近，证明目的基因已经完全导入到了e.coli bl21中。
85.6)重组大肠杆菌bl21/pet28a-alg62构建及诱导表达
86.1、将上述单菌落pcr检测阳性克隆后，提取重组质粒pet28a-alg62，按照上述步骤(5)导入到e.coli bl21感受态细胞中，构建重组e.coli bl21/pet28a-alg62菌株。然后利用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切验证，验证成功后，利用甘油管菌株保藏于-80℃冰箱中，备用；
87.2、将重组e.coli bl21/pet28a-alg62菌株划线培养后，挑取单菌落接种到5ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃过夜培养；以1％的接种量接种于50ml lb液体培养基中，37℃，200r/min培养，待od
600
为0.4-0.6时加入iptg诱导剂进行诱导表达。
88.3、以含空质粒菌株和未添加iptg诱导剂为对照组，添加iptg诱导剂的为实验组，培养之后离心收集菌体，通过sds-page鉴定目的蛋白是否表达。
89.参见图10重组褐藻胶裂解酶生产菌株全蛋白sds-page分析，注:m，低标注分子量蛋白质marker；1，e.coli bl21/pet28a-alg62细胞全蛋白(未经iptg诱导)；2，e.coli bl21/pet28a细胞全蛋白(添加iptg诱导剂)；3、4，e.coli bl21/pet28a-alg62细胞全蛋白
(添加iptg诱导剂)。
90.对重组菌株进行摇瓶培养，在37℃、200r/min，添加终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导，诱导表达进行sds-page，结果分析如图10所示，第一泳道为未添加诱导剂的e.coli bl21/pet28a-alg62细胞全蛋白，第二泳道为e.coli bl21/pet28a(+)细胞全蛋白，第三泳道和第四泳道为添加诱导剂后e.coli bl21/pet28a-alg62细胞全蛋白，对比可以发现，添加诱导剂后的细胞全蛋白比空质粒和未添加诱导剂的全蛋白要有一条明显的条带，大小介于44.3kda和66.4kda之间，而构建的褐藻胶裂解酶基因大小为61.46kda，第三泳道和第四泳道条带大小与预测的目的蛋白基本符合。与未诱导和空质粒相比可以确定该褐藻胶裂解酶基因表达成功，并将其命名为褐藻胶裂解酶alg62。
91.7)重组大肠杆菌酶活力测定：
92.将重组菌液体培养，4℃收集菌体，弃取上清，将沉淀用缓冲液悬浮进行超声破碎，4℃离心收集上清，即为粗酶液。取0.1ml适当稀释的酶液加上0.9ml海藻酸钠底物(0.5g海藻酸钠溶于100ml磷酸盐缓冲液中)30℃反应20min，待冷却后加入1ml dns沸水浴5min，冷水冷却后定容至10ml，于540nm处测定吸光度。
93.酶活力定义(u/ml)：单位时间内催化底物生成1μg的氨基葡萄糖所需的酶量。
94.酶活公式：u＝c
×n×
1000/(t
×
v)
95.c—还原糖浓度，n—稀释倍数，t—反应时间(min)，v—酶液体积
96.底物配制:50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph8.0)，0.5％的海藻酸钠，0.3mol/l氯化钠。
97.8)重组褐藻胶裂解酶的分离纯化：
98.将诱导发酵完成的菌液4℃，5000r/min离心收集，弃取上清液，称湿重，根据1g菌体加入5ml非变性裂解液的比例，充分悬浮菌体，在冰上超声裂解细菌(功率200w，工作3s，间歇5s，20min)，之后4℃12000r/min离心收集上清液；上清液用0.45μm的滤膜过滤，防止镍柱纯化时阻塞层析柱；所得溶液即为粗酶液。
99.9)重组褐藻胶裂解酶的酶学性质研究
100.①
不同反应温度对酶活力的影响及热稳定性研究
101.最适温度测定，将配制的底物置于20℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，60℃中，然后加入褐藻胶裂解酶测定酶活性，以最高酶活力值为标准计算相对酶活力。热稳定，将纯化后的酶液置于4℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃中水浴30min，测定其酶活。
102.②
不同ph对酶活力的影响及ph稳定性研究
103.最适ph的测定，将底物置于不同体系的ph下，柠檬酸缓冲液(ph4.0-6.0)，磷酸盐缓冲液(ph6.0-8.0)，tris-hcl缓冲液(ph8.0-9.0)中，然后加入酶液测定其酶活，以最高酶活为标准计算其相对酶活力。ph稳定性，将纯化后的酶液置于不同ph(4.0-9.0)的4℃冰箱处理24h后，测定其残留酶活力。
104.③
不同金属离子对酶活力的影响
105.采用不同的金属离子和化学试剂(cu
2+
，ca
2+
，mg
2+
，na
+
，sds)，以未加任何离子的反应体系为空白，测定其酶活。
106.将重组褐藻胶裂解酶液与0.5％的海藻酸钠溶液反应，探究不同温度下酶活力的变化，以测得的最高酶活为对照，计算得到不同温度下酶活的相对值。结果如图3所示：重组褐藻胶裂解酶的最适反应温度在30℃，当反应温度大于30℃时，酶活力开始下降，在温度达
到40℃时，酶活力降到了80％左右，达到50℃时，则酶活力降到了20％左右，达到60℃时酶活力几乎完全丧失，这表示该褐藻胶裂解酶的反应温度较为温和在20-40℃之间有良好的酶活性，在这温度下酶活力最高为130u/ml，这对于以后发酵生产具有重要参考价值。
107.为了研究酶的热稳定性，以4℃下的酶活为标准，测定酶在10℃到60℃范围内酶的稳定性，结果如图4所示，在低于30℃的环境里保存30min后，酶活几乎没有影响，当温度高于30℃后，酶活力开始呈现下降趋势，当温度达到40℃时，还保留80％的酶活性，过了40℃酶活力大幅度下降，到50℃时，酶活力保留了原来的20％左右，达到60℃时，酶活力几乎为0，因此对酶液的保存尽量在低温环境。
108.用不同的ph缓冲液配制不同的0.5％的海藻酸钠底物，以不同的缓冲液调节酶的反应体系，在低ph的环境下，以柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(ph4.0，ph4.5，ph5.0，ph5.5，ph6.0)为反应体系，在中性环境中以磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.0，ph6.5，ph7.0，ph7.5，ph8.0)为反应体系；碱性环境以tris-hcl缓冲液(ph8.0，ph8.5，ph9.0)为反应体系，测定不同ph下的重组酶的相对酶活。结果如图6所示，酶的最适ph为7.0，此时反应体系是50mm的磷酸盐缓冲液。当ph范围在6.5-8.0之间时，酶的活力仍在最高酶活的80％以上，说明该酶在中性环境下能发挥作用，当ph在4.0-6.0时，酶活力损失严重，在5.0以下时几乎没有酶活力。当ph达到8.0时，酶活力开始迅速下降，在ph为9.0时，酶活力下降到60％。当ph为6.0时，不同缓冲液对酶活也有影响，在磷酸盐缓冲液中酶活比在柠檬酸缓冲液中要高，而在ph8.0时，磷酸盐缓冲液与tris-hcl缓冲液对酶活影响不大。
109.将酶液置于上述三种不同的缓冲液中，在4℃冰箱保存24h，测定相对酶活。其结果如图5所示，该酶在ph6.0-ph9.0之间还保留有70％以上的酶活，说明该酶的ph稳定在中性和偏碱范围之中。
110.在以0.5％海藻酸钠为底物的反应体系中加入终浓度为1mmol/l的不同的试剂(cucl2，cacl2，mgcl2，kcl)和十二烷基硫酸钠(sds)，以没有添加此类任何离子的反应为空白，结果如图7所示，1mmol/l的ca
2+
，k
+
对重组褐藻胶裂解酶有促进作用，ca
2+
的促进作用十分明显提高了近60％；而sds，cu
2+
，mg
2+
对重组褐藻胶裂解酶有抑制作用，其中sds和cu
2+
离子对酶有很强的抑制作用。
111.参见图11-13，通过对其诱导温度、诱导时间、诱导剂添加浓度优化之后发现该基因alg62表达的褐藻胶裂解酶最适诱导温度为27℃，最佳诱导时间为8h，最适诱导剂添加浓度为0.8mmol/l，优化之后粗酶活力达到了81.34u/ml。对诱导表达之后的菌液进行超声破碎(200w，工作3s，间隔5s，20min)，经ni-nta亲和层析柱纯化，透析除盐，纯化之后测得酶液酶活为131.77u/ml，蛋白质浓度为1.48mg/ml，预测蛋白质分子量为61.46kda。
112.通过上述实验可以得知：
113.对重组褐藻胶裂解酶的酶学性质的初步研究得知，该重组酶最适反应温度是30℃，在4℃-50℃之间均能检测到活性。在热稳定性方面，重组酶在20℃-40℃范围内保温30min后，酶的相对活力仍在80％以上，高于40℃，酶活力急剧下降。酶的最适ph为7.0，在ph6.0-9.0之间，4℃保存24h后仍有70％的相对酶活性，说明该酶可以在中性和偏碱性环境中稳定存在。在添加终浓度为1mmol/l的ca
2+
、k
+
后，发现它们对重组酶酶活有促进作用，cu
2+
和sds对酶活有明显的抑制作用。
114.本发明通过一系列的分子手段对褐藻胶裂解酶的基因进行了异源表达，构建了
e.coli bl21/pet28a-alg62重组菌株。构建该菌株的目的是为了短时高效的获得目的蛋白，因为传统的野生型菌株分泌褐藻胶裂解酶有限，野生型菌株的发酵周期长，重组菌株的优势在于发酵条件稳定，发酵周期短，在工业化生产方面可以节约大量成本。
115.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。