一种贝莱斯芽孢杆菌株及其应用

1.本发明属于环境生物技术领域，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌株。


背景技术：

2.我国作为畜牧业大国，畜禽养殖开始向集约化方式发展，生猪规模化养殖过程产生的大量猪粪带来的处置问题，给环境造成了巨大的压力，同时也是资源的严重浪费。在猪粪资源化利用中，堆肥因其绿色、低成本、回收价值高等优点已成为最有效的处理方法，传统堆肥方式存在发酵周期长、发酵过程产生异味和重金属残留等问题。硫化氢由猪粪便和残余饲料中的含硫有机物经有害细菌分解产生。含量过高可引起角膜炎、结膜炎、刺激呼吸道黏膜，重者可导致死亡。长期慢性刺激则使猪体质下降、生产性能明显降低。因此深入研究处理猪粪堆肥过程中硫化氢的方法具有重要意义。由于目前的猪粪堆肥工艺无法彻底有效去除硫化氢，在堆肥过程中给环境造成了危害，因此寻找一株新方法处理猪粪堆肥过程中硫化氢迫在眉睫。


技术实现要素：

3.本发明的目的是要解决现有猪粪堆肥工艺无法彻底有效去除硫化氢，在堆肥过程中给环境造成了危害的问题，而提供一种贝莱斯芽孢杆菌株及其应用。
4.一种贝莱斯芽孢杆菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年06月13日，保藏号为cgmcc no.25067。
5.一种贝莱斯芽孢杆菌株用于去除猪粪好氧堆肥过程中产生的硫化氢。
6.本发明一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的性质如下：
7.一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10在lb固体培养基上培养24h后，显现的菌落特征为：菌落呈白色，不透明，表面光滑湿润，卵圆形，易挑取，边缘整齐。利用16s rrna的方法进行测序，序列比对可知，与菌株f10同源性最相近的是贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，相似度超过99.86％，将序列上传到ncbi数据库中，得到其登录号为nr075005。
8.本发明的有益效果：
9.一、本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10是从猪粪堆肥样品中筛选出来的硫化氢除臭菌株，能在30～65℃下生长并稳定发挥硫化氢去除作用，与不接菌的对照组相比，在堆肥初期接种的除臭菌剂，可较快地适应堆肥的高温环境，延长堆肥高温期的时间，减少堆体中硫化氢的释放量，达到固硫除臭的目的；一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的应用可以为猪粪堆肥的资源化和环境污染控制提供一条合理有效的途径；
10.二、本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10对硫化氢臭气的去除率可达55％～65％；
11.三、本发明可获得一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10。
附图说明
12.图1为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的系统发育树结果图；
13.图2为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10对硫化氢去除能力的测试曲线；
14.图3为实施例3中猪粪堆肥过程中温度的变化曲线；
15.图4为实施例3中猪粪堆肥过程中含水率的变化曲线；
16.图5为实施例3中猪粪堆肥过程中硫化氢臭气累积排放量的变化曲线。
具体实施方式
17.具体实施方式一：本实施方式一种贝莱斯芽孢杆菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年06月13日，保藏号为cgmcc no.25067。
18.本实施方式的有益效果：
19.一、本实施方式提供的一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10是从猪粪堆肥样品中筛选出来的硫化氢除臭菌株，能在30～65℃下生长并稳定发挥硫化氢去除作用，与不接菌的对照组相比，在堆肥初期接种的除臭菌剂，可较快地适应堆肥的高温环境，延长堆肥高温期的时间，减少堆体中硫化氢的释放量，达到固硫除臭的目的；一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的应用可以为猪粪堆肥的资源化和环境污染控制提供一条合理有效的途径；
20.二、本实施方式提供的一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10对硫化氢臭气的去除率可达55％～65％；
21.三、本实施方式可获得一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10。
22.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：一种贝莱斯芽孢杆菌株用于去除猪粪好氧堆肥过程中产生的硫化氢。其它步骤与具体实施方式一相同。
23.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：一种贝莱斯芽孢杆菌株用于去除猪粪好氧堆肥过程中产生的硫化氢具体是按以下步骤完成的：
24.一、以水稻秸秆粉为猪粪的辅料，将猪粪、水稻秸秆粉和水混合，得到堆料；
25.步骤一中所述的堆料中碳氮比为30，含水率为70％；
26.二、将贝莱斯芽孢杆菌菌悬液投加到堆料中，搅拌均匀，再使用半透膜覆盖好，进行堆肥，堆肥时间为28天～30天，期间翻堆2～3次；
27.步骤二中所述的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液与堆料的质量比为(10～15):100。其它步骤与具体实施方式一或二相同。
28.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤二中所述的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液是按以下步骤制备的：
29.一、将甘油冷冻保存的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10取出，快速解冻，吸取100μl菌液在活化培养基上分区划线，再在30℃下培养16h～18h，得到活化后的贝
莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10；
30.步骤一中所述的活化培养基的培养基配方为：蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、麦芽膏3.0g、酵母膏3.0g、琼脂20.0g和水1000ml；
31.二、将活化后的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10接种于灭菌的发酵培养基中，再在30℃的恒温摇床中摇培；
32.步骤二中所述的摇培的时间为8h～24h；
33.步骤二中所述的发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl 10g和水1000ml，ph为7.2～7.5，在121℃下灭菌30min。其它步骤与具体实施方式一至三相同。
34.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤二中所述的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液中含菌量为2
×
109cfu/ml。其它步骤与具体实施方式一至四相同。
35.采用以下实施例验证本发明的有益效果：
36.实施例1：贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10：
37.1.所用培养基：
38.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g/l，蛋白胨10.0g，nacl 5.0，琼脂20％，水1000ml；在121℃下灭菌15min；
39.h2s选择性培养基：葡萄糖5.0g/l，k2hpo
4 0.5g/l，kno31.0 g/l，mgcl20.5 g/l，nacl0.5g/l，nh4cl0.5g/l，na2co31.0 g/l，fecl
2 0.01g/l，水1000ml；在121℃下灭菌15min；
40.lb固体培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，琼脂20.0g，去离子水1000ml，ph值7.0～7.2。
41.2.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10菌株的筛选：
42.样品来源于黑龙江省哈尔滨市周边养猪场的猪粪；
43.选取猪粪堆肥不同阶段的样品各10g置于装有90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，并稀释成10-1
～10-6
不同浓度梯度；选取稀释倍数为10-4
、10-5
和10-6
的稀释液100μl涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养5d后，利用平板划线分离法进一步分离纯化，纯化后的菌株在显微镜下根据形态特征分类编号，保存在4℃斜面备用，对已分离的菌株进行液培。
44.菌株初选：将菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基上置于180r/min摇床内30℃温培养3d，按5％(v/v)的接种量接种至装有200ml h2s选择性培养基的三角瓶中，在三角瓶中放置一个50ml离心管，内装有12ml质量分数为25％的h2so4溶液，向离心管中加入4g硫化亚铁(fes)后密封三角瓶，在30℃、180r/min摇床上恒温培养5d后，观察菌液浑浊情况，若浑浊表明有降解h2s的能力。挑选单菌落进行反复划线以获得纯菌株，最终获得51株纯菌株，将菌株接种于斜面4℃保存用于后续实验；
45.菌株复选：取90g与水稻秸秆粉混匀的猪粪(水稻秸秆粉与猪粪的质量比为5:20)置于300ml的三角瓶中，将初选的菌株培养活化后，按猪粪质量的10％接种至三角瓶中，三角瓶中放入装有10ml锌胺络盐吸收液的离心管用于吸收h2s，密封后置于38℃恒温室中发酵培养。对照组加入等量灭活的菌液，每个处理3个重复，培养5d后采用碘量法测定h2s浓度的变化选取。其中有1株菌对硫化氢的去除效果高达60％以上，将其编号为f10用于后续研
究。
46.3.菌株的鉴定：
47.将菌株f10接种于lb固体培养基上，将平板放置于32℃的培养箱中培养24h后，对菌株的表观形态进行观察发现：菌落呈白色，不透明，表面光滑湿润，卵圆形，易挑取，边缘整齐。
48.将菌株f10寄送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi数据库中进行序列比对，比对结果显示，与菌株f10同源性最高的为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，二者的相似度超过99.86％，将序列上传到ncbi数据库中，得到其登录号为nr075005。在mega x软件中构建系统发育树，得到的系统发育分析结果如图1所示。
49.图1为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的系统发育树结果图。
50.实施例2：实施例1中筛选出来的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10对硫化氢去除能力的测试，具体是按以下步骤完成的：
51.一、以水稻秸秆粉为猪粪的辅料，将猪粪、水稻秸秆粉和水混合，得到堆料，将90g堆料装入300ml三角瓶中，三角瓶中放入装有10ml锌胺络盐吸收液的离心管用于吸收h2s；
52.步骤一中所述的堆料中水稻秸秆粉与猪粪的质量比为5:20；
53.步骤一中所述的堆料中碳氮比为30，含水率为70％；
54.步骤一中所述的锌胺络盐吸收液制备方法为：称量5g硫酸锌(znso4·
7h2o)溶于500ml水中，得到溶液a；另称量6g氢氧化钠溶于300ml水中，得到溶液b；将溶液a和溶液b混合，此时有氢氧化锌沉淀形成；称量70g硫酸铵加入溶液中，边加边搅拌，使氢氧化锌沉淀溶解，再加入50g甘油，搅匀再用水稀释至1l，得到锌胺络盐吸收液；
55.二、将贝莱斯芽孢杆菌菌悬液投加到堆料中，密封后置于38℃恒温室中发酵培养；培养5d后采用碘量法测定h2s浓度的变化，测定结果如图2所示；
56.步骤二中所述的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液与堆料的质量比为10g:100g；
57.步骤二中所述的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液是按以下步骤制备的：
58.①
、将甘油冷冻保存的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10取出，快速解冻，吸取100μl菌液在活化培养基上分区划线，再在30℃下培养16h～18h，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10；
59.步骤一中所述的活化培养基的培养基配方为：蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、麦芽膏3.0g、酵母膏3.0g、琼脂20.0g和水1000ml；
60.②
、将活化后的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10接种于灭菌的发酵培养基中，再在30℃的恒温摇床中摇培；
61.步骤
②
中所述的摇培的时间为8h；
62.步骤
②
中所述的发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl 10g和水1000ml，ph为7.2～7.5，在121℃下灭菌30min。
63.对照组为未接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10。
64.图2为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10对硫化氢去除能力的测试曲线；
65.从图2可知，贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10随着堆肥的进行，去除率
逐渐上升，在堆肥第4d后发挥作用，第2d去除率为负值原因可能是，投加菌株相较于空白对照微生物活性更高导致初期硫化氢的释放高于对照组。去除率在第8d时到达最高值65％，第10d有所下降，在整个堆肥周期能够保持良好的去除效果。
66.实施例3：实施例1中筛选出来的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10在猪粪半透膜好氧堆肥中的应用具体是按以下步骤完成的：
67.构建半透膜好氧发酵系统，将原料(以水稻秸秆粉为猪粪的辅料，将20kg新鲜猪粪、5kg水稻秸秆粉和水混合，得到堆料；堆料中碳氮比为30，含水率为70％；)置于50
×
50
×
33cm的保温泡沫箱中，泡沫箱内粘贴一层pvc软板隔湿，表面覆盖半透膜，四周使用胶带密封，底部铺设通气软管，使用胶带固定，使用气泵每天通风5h，通气量为2l/min；为保证堆体表面及内部物料发酵均匀，每6d翻堆一次，直到发酵结束。本实验设置了两组猪粪半透膜好氧堆肥实验，1号堆体为空白组，2号堆体为实验组，投加贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10，将贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10发酵24h的菌悬液，以10％(质量分数)的接种量，接种于2号堆体，同时空白组(1号堆体)添加灭菌后的培养基(灭菌后的培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl 10g和水1000ml，ph为7.2～7.5，在121℃下灭菌30min)。温度采用电子温度计测量，硫化氢采集与测定方法采用碘量法测定。采用大气采样仪采集h2s，采样后室温保存于24h内分析测定。气体去除率＝(对照组的释放量-试验组释放量)/对照组释放量
×
100％。含水率是通过在105℃下将样品烘至恒重，利用烘干前后的重量差计算得到。堆肥总时间为28天；
68.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10发酵24h的菌悬液是按以下步骤制备的：
69.一、将甘油冷冻保存的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10取出，快速解冻，吸取100μl菌液在活化培养基上分区划线，再在30℃下培养18h，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10；
70.步骤一中所述的活化培养基的培养基配方为：蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、麦芽膏3.0g、酵母膏3.0g、琼脂20.0g和水1000ml；
71.二、将活化后的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10接种于灭菌的发酵培养基中，再在30℃的恒温摇床中摇培；
72.步骤二中所述的摇培的时间为24h；
73.步骤二中所述的发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl 10g和水1000ml，ph为7.5，在121℃下灭菌30min。
74.实施例3中猪粪堆肥过程中的温度变化如图3所示；
75.图3为实施例3中猪粪堆肥过程中温度的变化曲线；
76.从图3可知，添加贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的实验组在堆肥第4天即达到61.42℃，进入堆肥高温期，并在第5天达到最高温度69.55℃，而此时空白组的最高堆肥温度为68.1℃，整个堆肥周期，实验组比空白组的温度较高，说明贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10添加有利于堆肥温度的提升。同时与未接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的空白组相比，接菌组的高温期持续6天，而空白组的高温期仅为5天，接种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的实验组高温期比空白组长1天，可有效延长堆肥高温期。
77.实施例3中猪粪堆肥过程中的含水率变化如图4所示；
78.图4为实施例3中猪粪堆肥过程中含水率的变化曲线；
79.从图4可知：随着发酵的进行，堆体温度逐渐升高，堆体含水率均逐渐降低。升温期水分散失并不明显，是因为简单化合物分解时会释放水分，高温期及腐熟期失水更多，是因为温度较高导致水分更容易散失。经过28d的发酵，1号堆和2号堆含水率由开始的70.1％和70.3％分别下降至50.1％和52.3％。
80.实施例3中猪粪堆肥过程中的硫化氢浓度变化如图5所示；
81.图5为实施例3中猪粪堆肥过程中硫化氢臭气累积排放量的变化曲线；
82.由图5可知，添加贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的实验组h2s释放量受到了明显的抑制作用，空白组h2s的释放量在第8d到达了最高点，为4381μg/m3，随着堆肥的进行，硫化氢的释放量开始快速下降，在堆肥结束后释放量为22μg/m3。添加贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)f10的实验组h2s的释放量在第4d到达最高点，为2645μg/m3，随着堆肥的进行，h2s的释放量逐渐开始下降，在第4-20d期间，释放量逐渐下降，20d后趋于平缓，在堆肥结束后释放量为15μg/m3。堆体堆肥结束后的h2s释放量都低于0.03mg/m3符合国家恶臭气体臭气排放浓度一级标准。