CCHFV重组真核表达载体pVAX1-CCHFV-Gc、构建方法和应用

cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc、构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc、构建方法和应用。


背景技术：

2.克里米亚-刚果出血热病毒(cchfv)是一种婢媒自然免疫源性病毒，该病毒可以通过婢虫叮咬而感染，易感染人类，它的临床症状与其他型的出血热相似，潜伏期2-12天左右，临床表现为起病急骤、体温上升、头痛剧烈、恶心呕吐等，有较高的致死率。光学镜下，在鼠脑部的感染组织中能够观察到吉姆萨染色呈嗜碱性的如红细胞大小的细胞质涵体。
3.针对cchfv疫苗的研究虽然有很多，但是目前仍未研发出具有良好疗效的疫苗(参考文献：“郭雷鸣,董兆昱,程林峰.克里米亚-刚果出血热病毒疫苗的研究进展[j].热带医学杂志,2018,18(10):5”)，所以开发针对克里米亚-刚果出血热病毒的疫苗仍是非常有必要的研究。
[0004]
cchfv的基因组中含有m段、s段以及l段三部分，其中m段编码包膜糖蛋白gc和gn，是病毒致病的关键蛋白，现有专利有针对gc设计的多表位串联产品，无法充分刺激机体的免疫反应。本发明以真核表达载体pvax和gc的完整抗原为基础，构建了真核表达载体pvax1-cchfv-gc，获得了免疫效果良好的重组cchfv dna疫苗。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc、构建方法和应用。
[0006]
本发明提供了一种cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的制备方法，合成cchfv毒株的结构蛋白gc的基因，gc的基因核苷酸序列如seq id no.1所示，采用同源重组方法将扩增出的上述基因插入pvax1质粒载体，构建成pvax-cchfv-gc重组真核表达载体。
[0007]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的制备方法，所述cchfv毒株为ibar10200。
[0008]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的制备方法，gc的基因插入pvax1质粒载体的ecor i与xba i之间。
[0009]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的制备方法，鉴定pvax1-cchfv-gc重组真核表达载体所用的pcr方法的引物序列如下：
[0010]
pcr方法所用引物如下：
[0011]
primer-f：5
’‑
tccagtgtggtggaattcatgttcctggacagcac-3’；
[0012]
primer-r：5
’‑
ttaaacgggccctctagatcactacccgatgtgggt-3’。
[0013]
本发明还提供了一种由上述方法制备的cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc。
[0014]
本发明还提供了一种上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的应用，所述
pvax1-cchfv-gc用于制备cchfv疫苗。
[0015]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的应用，所述pvax1-cchfv-gc免疫机体后可以抑制cchfv tecvlp的感染，所以可将所述pvax1-cchfv-gc用于制备cchfv tecvlp感染抑制剂。
[0016]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的应用，所述pvax1-cchfv-gc免疫机体后可以有效促进免疫因子il-10的表达，所以可将所述pvax1-cchfv-gc用于制备免疫因子il-10的表达促进剂。
[0017]
优选的，上述cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的应用，所述pvax-cchfv-gc免疫机体后可以有效刺激机体产生以中和抗体为代表的体液免疫应答，所以可将所述pvax-cchfv-gc用于制备细胞免疫反应促进剂。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019]
1、本发明利用真核表达载体pvax1为基础，构建了重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc，最终获得了以上重组cchfv dna疫苗(也就是pvax1-cchfv-gc)。免疫动物后检测，pvax1-cchfv-gc能够有效刺激机体产生以中和抗体为代表的体液免疫应答。此外，以上疫苗可以有效保护机体免受cchfv的攻击，具有很好的动物保护效果。研究结果提示，pvax1-cchfv-gc疫苗具有作为cchfv安全高效新型疫苗的潜力。
[0020]
与以往的研究及专利相比，我们使用的是pvax1载体，该载体安全性好，表达量高，已被美国fda认证许可用于人类dna疫苗。此外，我们研究的抗原是富含cchfv中和抗原表位的gc蛋白。本发明使用的是gc的完整抗原，能够充分刺激机体的免疫反应，无论从抗原的种类以及同一抗原下的广度，本发明都更胜一筹。
附图说明
[0021]
图1为pvax-cchfv-gc重组质粒载体的构建与鉴定结果；
[0022]
a，pvax-cchfv-gc重组质粒载体pcr结果，其中，泳道1为dna marker(5000bp)，泳道2为pvax-cchfv-gc的pcr结果；
[0023]
b，western-blot结果，其中，泳道1为蛋白marker(11-245kd)，泳道2为正常对照细胞，泳道3为pvax1转染细胞，泳道4为pvax-cchfv-gc转染细胞；
[0024]
图2为免疫荧光结果；
[0025]
图3为特异性抗体(a)和中和抗体(b)检测结果；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；
[0026]
图4为诱导免疫因子检测结果；*表示p＜0.05；
[0027]
图5为保护效果检测；**表示p＜0.01，***表示p＜0.001；
[0028]
其中，a-c分别是qpcr检测的cchfv tecvlp感染小鼠的肝脏、脾、肾结果；
[0029]
d-f分别是试剂盒检测的cchfv tecvlp感染小鼠的的肝脏、脾、肾结果。
具体实施方式
[0030]
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0031]
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。dpbs购买自赛默飞。
[0032]
实施例1
[0033]
一种cchfv重组真核表达载体pvax1-cchfv-gc的构建方法，包括以下步骤：
[0034]
(1)cchfv重组质粒载体的构建及鉴定
[0035]
委托上海生工合成cchfv毒株ibar10200的结构蛋白gc的基因，gc的基因核苷酸序列如seq id no.1所示，采用同源重组方法将上述gc的基因序列插入pvax1质粒载体的ecor i与xba i之间，构建成pvax-cchfv-gc重组真核表达载体。
[0036]
gc的基因核苷酸序列(1941bp)如下：
[0037]
atgttcctggacagcaccgccaaaggcatgaagaacctgctgaacagcaccagcctggaaacatccctgtctatcgaggctccctggggggcaattaacgtccagagtacctataagcctaccgtgtcaacagctaatatcgcactgagctggagctccgtcgagcacagagggaacaaaatcctggtgagtggaaggagtgaatcaattatgaagctggaggaaagaaccggcatctcttgggacctgggggtggaggatgctagcgaatccaagctgctgacagtgagcgtcatggacctgtcacagatgtacagccccgtctttgagtatctgtccggcgatcgacaagtgggagaatggcccaaagccacatgtactggcgactgccctgagagatgcgggtgtacttctagtacctgtctgcacaaggaatggccacattcccgaaactggcggtgtaatccaacctggtgctggggagtgggaacaggatgcacttgctgtggcctggacgtgaaagatctgtttacagattacatgttcgtcaaatggaaggtggagtatatcaagacagaagcaatcgtgtgcgtggagctgactagccaggaacgccagtgctccctgattgaggccggaacccgattcaatctgggccccgtgaccatcacactgagcgagcctcgaaacattcagcagaagctgccacccgaaatcattacactgcacccaagaatcgaggaaggcttctttgacctgatgcatgtccagaaagtgctgtctgccagtaccgtgtgcaagctgcagagctgcacacacggagtgccaggagatctgcaggtctaccatatcggaaacctgctgaaaggcgacaaagtgaatgggcacctgatccataagattgagccccactttaatacctcctggatgtcttgggatggctgtgacctggattactattgcaacatgggcgactggccttcctgcacttacaccggggtcacacagcacaatcatgcatctttcgtgaacctgctgaatatcgagaccgattacacaaagaacttccacttccatagcaagagggtgactgcacacggggacaccccacagctggatctgaaagctcgaccaacctacggagcaggagagatcacagtgctggtcgaggtggctgacatggaactgcatactaagaaaatcgaaatttctggactgaagttcgccagtctggcttgcaccggatgttatgcatgctcaagcggcatcagctgcaaagtccggattcacgtggacgagccagatgaactgaccgtccatgtgaagtccgacgatcccgatgtggtcgccgcttcctctagtctgatggccaggaagctggagtttggcactgactcaaccttcaaagccttcagcgccatgcctaagacctccctgtgcttctacatcgtggagcgcgaacactgtaaatcatgcagcgaggaagatactaagaaatgcgtgaacaccaagctggaacagccacagtccatcctgattgagcataaagggaccatcattggaaagcagaacagcacatgtactgctaaggcatcttgctggctggagagtgtgaaatcattcttttatggcctgaagaacatgctgagcggcatctttgggaacgtgttcatggggattttcctgtttctggccccctttatcctgctgattctgttctttatgttcggatggagaatcctgttctgctttaaatgctgtaggcgcacacgaggcctgttcaaataccggcacctgaaggacgatgaggaaactggatatcgacggatcattgagaagctgaacaataagaaaggcaaaaataagctgctggacggggagaggctggctgataggcggattgctgaactgttttccacaaagacccacatcgggtagtga
[0038]
提取质粒(pvax-cchfv-gc重组真核表达载体)后采用pcr方法和基因测序方法鉴定构建载体是否正确。
[0039]
pcr方法所用引物如下：
[0040]
primer-f：5
’‑
tccagtgtggtggaattcatgttcctggacagcac-3’，seq id no.2；
[0041]
primer-r：5
’‑
ttaaacgggccctctagatcactacccgatgtgggt-3’，seq id no.3。
[0042]
pcr体系如下：
[0043]
反应体系(25μl)：10
×
pcr buffer 2.5μl；2.5mm dntps 1.0μl；10μm上游和下游引物各0.5μl；诺唯赞公司phanta max super-fidelity dna聚合酶0.2μl；模版1.0μl；补水至25μl。
[0044]
pcr扩增条件为：95℃预变性5分钟；进入95℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
[0045]
将构建好的上述pvax-cchfv-gc重组真核表达载体转染细胞，并采用免疫荧光方法(转染hela细胞)和western-blot方法(转染293t细胞)鉴定相应抗原蛋白是否正确表达。结果参见图1-2，结果显示上述重组质粒载体均能正确表达相应抗原蛋白。
[0046]
(2)cchfv重组质粒载体免疫小鼠方法
[0047]
将上述构建的pvax-cchfv-gc重组真核表达载体按照70μg/200μl/只的剂量免疫小鼠，对照组包含dpbs组、pvax1载体组，每组8只小鼠。采用肌肉注射方式免疫，共免疫3次，每次间隔3周。
[0048]
(3)cchfv tecvlp感染重组质粒载体免疫小鼠方法
[0049]
采用前期构建好的cchfv tecvlp(stephanie devignot,eric bergeron,stuart nichol,ali mirazimi,friedemann weber.a virus-like particle system identifies the endonuclease domain of crimean-congo hemorrhagic fever virus.journal of virology,2015,89(11):5957-5967)感染上述(2)中免疫后的小鼠，每组攻击4只。感染方式和剂量为腹腔注射500μl/只，感染3天后处死小鼠，取主要脏器：心、肝、脾、肺、肾、脑。
[0050]
(4)cchfv重组质粒载体免疫效果评价
[0051]
(4.1)免疫小鼠体液免疫效果评价
[0052]
将上述(2)免疫3次后的小鼠每组取4只处死，取血液和脾脏，获得血清和脾细胞，用elisa方法检测血清中特异性抗体，采用nanoluc试剂盒方法检测中和抗体滴度。pvax-cchfv-gc重组质粒载体的特异性抗体和中和抗体检测结果参见图3，结果显示，pvax-cchfv-gc免疫组的小鼠血清中的特异性抗体(图3a)和中和抗体(图3b)水平较对照组均有明显上升。
[0053]
(4.2)免疫小鼠细胞免疫效果评价
[0054]
用elispot方法检测上述(2)免疫3次后的小鼠脾细胞分泌il-10免疫分子的水平，用ctl杀伤实验检测脾细胞对相应靶细胞的杀伤能力，用流式方法检测脾淋巴细胞的分化水平。图4表明pvax-cchfv-gc免疫小鼠后能够促进小鼠的免疫因子il-10产生。elispot、ctl杀伤实验以及流式方法均表明pvax-cchfv-gc免疫小鼠后能够促进小鼠的细胞免疫反应。
[0055]
(4.3)免疫小鼠保护效果评价
[0056]
用q-pcr和nanoluc试剂盒方法检测上述(3)中cchfv tecvlp感染小鼠后主要脏器中cchfv tecvlp的含量。结果参见图5，pvax-cchfv-gc免疫组中的小鼠较对照组能够明显地抵抗住cchfv tecvlp对于机体的感染，从而发挥保护作用。
[0057]
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利
要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0058]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。