Circ-0098181在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物中的用途

circ-0098181在制备肝纤维化检测试剂盒及治疗肝纤维化药物中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，涉及一种检测肝纤维化的试剂盒和治疗肝纤维化的药物，具体来说是circ-0098181在制备检测肝纤维化的试剂盒及治疗肝纤维化药物中的用途。


背景技术：

2.肝纤维化是指肝脏细胞外基质(即胶原、糖蛋白和蛋白多糖等)的弥漫性过度沉积与异常分布，是肝脏对慢性损伤的病理性修复反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节。肝纤维化进一步发展可引起肝小叶结构紊乱，肝细胞结节性再生，形成假小叶结构即肝硬化，临床上出现肝功能减退和门静脉高压症表现。目前，临床上尚无特异、有效的抗肝纤维化治疗方法，主要通过治疗引起肝损伤的基础疾病来缓解肝损伤和炎症，并对肝纤维化进行防治。而抗肝纤维化药物开发仍面临很大挑战，主要是由于肝纤维化的形成过程和机制复杂，影响因素众多，且个体之间存在较大差异。因此，迄今尚无有效的化学药物和生物制剂用于临床治疗。临床试验存在的主要问题有：慢性肝病肝纤维化一般病程较长，临床试验不易将生存获益或临床失代偿事件发生减少作为临床终点；发现新的药物需要长期(8.5～14.0年)和大量经济投入；现在的抗肝纤维化药物试验仍需要肝活检判断疗效，亟需理想的生物标志物和影像学检测技术以缩短试验间期和无创性评估等。
3.血浆、血清中游离rna，包括mirna、snorna、lncrna和circularrnas（circrnas）的发现是科学发展史上的一个重大突破。目前对circrnas在循环血中的来源及其能稳定存在机制还未完全阐明。既往研究推测循环rna的来源包括被动过程和主动过程，被动过程即疾病细胞坏死后游离rna进入循环血中；主动过程指circrna 通过以凋亡小体或者微粒体形式从细胞中释放。另有研究指出circrna的结构主要由一个环状环和多个microrna结合位点组成。封闭结构使circrna能够抵抗rna降解途径。由于循环生物标志物收集方便和相对非侵入性，使它能够成为疾病的筛选工具。因此，识别与肝纤维化过程直接相关的circrna，并且可以用作肝纤维化的诊断标记物，有很深远的临床意义。
4.此外，circrna作为mirna海绵调节基因表达。许多circrna已被证明存在于细胞核中，circrna-mirna轴参与各种级联信号通路，包括凋亡、侵袭、血管化和转移相关的级联信号。重要的是，一些证据表明，circrna可以在转录或转录后水平调节致病性相关基因的表达。非编码rna如microrna和长非编码rna已被报道为肝星状细胞激活的重要调节因子，并参与肝纤维化/肝硬化的过程。与microrna和长非编码rna一样，circrna也被报道与肝星状细胞激活有关。
5.正在研开发的抗肝纤维化治疗的靶点和实验药物很多，主要有抵抗肾素-血管紧张素系统的血管紧张素系统的血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂（如厄贝沙坦和洛沙坦）、cxc趋化因子受体（cxc chemokinereceptor，ccr）2和ccr5双重拮抗剂
（cenicriviroc）、小分子泛半胱天冬酶抑制剂（emricasan）、凋亡信号调节激素酶1抑制剂（selonsertib）、瘦素的天然反向调节剂脂联素、过氧化物媒体增殖物激活受体-γ核受体的合成配体噻唑烷二酮类、胰高糖素样肽-1类似物利拉鲁肽、抑制tgf-β1和可溶性受体拮抗剂或蛋白酶（如羟尼酮）、脯氨酰羟化酶抑制剂、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1抗体、松弛素（serelaxin）、内皮素-1拮抗剂和受体拮抗剂、赖氨酰氧化酶样蛋白2抗体（gs-6624）、肝细胞保护剂肝细胞核因子1α和4α等。这些药物尚处在临床前和临床试验阶段，期待好的疗效和安全性。
6.目前，尚缺乏血清特异性肝纤维化诊断指标，根据单一血液指标对肝纤维化的评估作用有限，联合检测和评估可提高诊断价值，但尚不能替代肝穿刺。同时肝纤维化的有效干预尚不尽如人意。在研开发的抗肝纤维化治疗的靶点和实验药物很多，但尚处在临床前和临床试验阶段。
7.circ-0098181（名称来源于circbase在线数据库）是一种circrna。与传统的线性rna不同，circrna作为一类特殊的非编码rna分子，其空间构型呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。


技术实现要素：

8.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了circ-0098181在制备检测肝纤维化的试剂盒及治疗肝纤维化药物中的用途，所述的这种circ-0098181在制备检测肝纤维化的试剂盒及治疗肝纤维化药物中的用途要解决现有技术中的肝纤维化检测准确性不高、没有特效药物有效阻止或者逆转肝纤维化的技术问题。
9.本发明提供了circ-0098181在制备诊断肝纤维化的生物标记物中的用途。
10.本发明还提供了检测circ-0098181的试剂在制备诊断肝纤维化的试剂盒中的用途，检测circ-0098181的试剂包括：基因特异引物的上游引物：tgttgacaccttgaagcagag，(seq id no.1)基因特异引物的下游引物：catctgcttccccatacgga。(seq id no.2)本发明还提供了circ-0098181在制备诊断肝纤维化的试剂盒中的用途。
11.本发明还提供了circ-0098181在制备治疗肝纤维化药物中的用途。
12.本发明还提供了一种表达circ-0098181的载体在制备治疗肝纤维化的药物的用途。
13.进一步的，所述的载体为腺病毒。
14.本发明提供了血清检测circ-0098181在制备诊断肝纤维化检测试剂盒以及能够调控circ-0098181的物质在制备能够治疗肝纤维化的产品中的应用。本发明通过研究circ-0098181在人肝组织中的表达以及其在肝纤维化过程中的作用及机制，发现circ-0098181在肝纤维化患者肝组织中表达明显下降，且增加肝星状细胞中circ-0098181表达能够减轻肝纤维化的病情进展，circ-0098181腺病毒治疗由taa诱导的肝纤维化小鼠，报告基因发现circ-0098181可抑制mir-484表达，进而调控星状细胞的自噬相关基因和肝纤维化相关基因表达。本发明对未来为肝纤维化的早期无创诊断及治疗策略的选择具有重要参考意义。
15.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明同时兼顾检测和治疗，有望
成为肝纤维化的无创性诊断和有效治疗方法的选择。同时本发明避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案。
16.附图说明：图1circ_0098181在肝纤维化中表达下降。
17.图2过表达circ_0098181可抑制星状细胞的增殖和迁移。
18.图3体外过表达circ_0098181可抑制肝纤维化相关基因和蛋白表达。
19.图4体内过表达circ_0098181可抑制肝纤维化相关基因和蛋白表达。
20.具体实施方式：实施例1hsa_circ_0098181基本信息及序列全长我们分别收集了5例人肝癌组织标本和5例人肝脏癌旁组织进行rna-seq测序分析，以确定人circ_0098181在肝纤维化肝组织和正常肝组织中的表达差异和circ_0098181全长序列。将全长序列与circrna在线数据库circbase进行序列比对，确认该rna信息。
21.方法：抽提待测序组织rna，制备测序反应体系，纯化标记/扩增的rna并对产生的crna进行质控，碱基序列杂交，杂交序列洗涤，计算机结果扫描和数据分析。将分析后所得全长序列与circrna在线数据库circbase进行序列比对，确认该rna信息。
22.亲本基因：sox5，长度：443nt染色体定位：chr12:23998917-24048958全部序列：gatgtcttccaagcgaccagcctctccgtatggggaagcagatggagaggtagccatggtgacaagcagacagaaagtggaagaagaggagagtgacgggctcccagcctttcaccttcccttgcatgtgagttttcccaacaagcctcactctgaggaatttcagccagtttctctgctgacgcaagagacttgtggccataggactcccacttctcagcacaatacaatggaagttgatggcaataaagttatgtcttcatttgccccacacaactcatctacctcacctcagaaggcagaagaaggtgggcgacagagtggcgagtccttgtctagtacagccctgggaactcctgaacggcgcaagggcagtttagctgatgttgttgacaccttgaagcagaggaaaatggaagagctcatcaaaaacgagccggaag。(seqidno.3)实施例2为了更好的研究circ_0098181在肝纤维化中的作用，我们将上文中5例人肝癌组织标本和5例人肝脏癌旁组织，抽提rna进行rt-pcr分析。并用tgf-β10ng/ml处理lx2细胞48h，以激活星状细胞来进一步检测circ_0098181的表达变化。
23.同时，我们针对circ_0098181设计了一对特异性引物（上游引物1：tgttgacaccttgaagcagag(seqidno.1)；下游引物：catctgcttccccatacgga(seqidno.2)），并运用qpcr技术检测circ_0098181的表达和分子成环验证，结果发现，与正常肝组织相比，circ_0098181在纤维化、硬化肝组织中的表达显著下降。用tgf-β刺激lx2细胞后，colia1、α-sma等基因表现显著上升，提示细胞活化，而circ_0098181表达显著下降。
24.以上结果表明circ_0098181与肝纤维化密切相关，揭示circ_0098181在临床上有作为检测纤维化的血清标志物的潜能，从而通过非侵入性的手段早期发现并诊断肝纤维化。
25.结果如图1所示，circ_0098181在肝纤维化中表达下降：a.circ_0098181在肝纤维化组织中表达下降；b.circ_0098181在活化的lx2细胞中表达下降。*p《0.05，**p《0.01，p《0.001。
26.实施例3为了进一步验证circ_009818在肝纤维化中的作用，我们用circ_009818慢病毒感染lx2细胞，48h后观察细胞荧光，观察到90%的lx2细胞显示绿色荧光，用puro进行筛选，继续培养至14天后收集rna，抽提rna后逆转成cdna后进行qrt-pcr 实验验证circ_0098181的过表达情况，最终构建了过表达circ_0098181的lx-2稳转株circ_0098181-lx2和nc稳转株nc-lx2。利用稳转株进行体外增殖（cck-8实验），将约每孔3000的细胞种入96孔板中，进行每日连续细胞增殖检测。利用稳转株进行迁移试验（transwell实验），将约每孔3万lx2细胞种入带有小室的24孔板，进行细胞迁移实验，48h后进行结晶紫染色的染色，观察细胞迁移情况。
27.结果显示，过表达circ_0098181后，lx2、hsc-t6细胞的增殖及迁移能力下降。进一步rt-pcr结果显示过表达circ_0098181后，lx2和hsc-t6细胞的纤维化相关基因colia1、α-sma等显著下降，western-blotting结果显示colia1、α-sma蛋白表达显著下调。同时还发现，过表达circ_0098181后，lx2和hsc-t6细胞的gpx4表达亦显著降低，提示circ_0098181可能通过调控铁死亡影响肝纤维化。以上结果可以表明过表达circ_0098181可抑制肝纤维化，揭示circ_0098181在临床上有作为干预措施缓解肝纤维化的进展，达到逆转肝纤维化的目的。
28.如图2所示，过表达circ_0098181可抑制星状细胞的增殖和迁移：a.过表达circ_0098181可抑制lx-2、hsc-t6细胞增殖； b. 过表达circ_0098181可抑制lx-2、hsc-t6细胞迁移。
29.图3所示，体外过表达circ_0098181可抑制肝纤维化相关基因和蛋白表达：a. 过表达circ_0098181可下调lx2细胞纤维化相关基因的表达；b. 过表达circ_0098181可下调lx2细胞纤维化相关蛋白的表达；c. 过表达circ_0098181可下调hsc-t6细胞纤维化相关基因的表达；d. 过表达circ_0098181可下调hsc-t6细胞纤维化相关蛋白的表达。*p《0 .05，**p《0.01，p《0.001。
30.图4所示，体内过表达circ_0098181可抑制ccl4诱导的小鼠肝纤维化。
31.实施例4同时用ccl4诱导小鼠肝纤维化模型，体内验证circ_0098181对肝纤维化的作用。
32.我们将实验动物分为2组，分别为ccl4造模+对照腺病毒治疗组、ccl4造模+ circ_0098181腺病毒治疗组。同时用ccl4诱导小鼠肝纤维化模型，体内验证circ_0098181对肝纤维化的作用。我们将实验动物分为2组，分别为ccl4造模+对照腺病毒（ad-nc）治疗组、ccl4造模+ circ_0098181腺病毒（ad-circ_0098181）治疗组。向两组小鼠的腹腔注射5％ccl4，每周2次。造模第6周，鼠尾静脉分别注射ad-nc和ad-circ_0098181，之后继续向两组小鼠的腹腔注射5％ccl4，至10周时，麻醉处死小鼠取肝组织冻存以及石蜡包埋。
33.通过将ad-nc组与ad-circ_0098181组肝组织切片进行he和masson染色，可见ad-nc组小鼠肝脏结构被破坏，肝细胞坏死，肝索排列紊乱。ad-circ_0098181组与ad-nc组相比肝脏结构明显恢复，肝细胞坏死减少，肝索围绕中央静脉呈放射状排列。
34.he染色步骤：(1)脱蜡：将石蜡切片首先放入二甲苯ⅰ20分钟，然后放入二甲苯ⅱ中室温静置20分钟(当室温过低时可以将二甲苯放入37℃恒温箱中)；
(2)水化：从二甲苯ⅱ中取出石蜡切片，分别放入梯度无水乙醇中再水化100％ⅰ、 100％ⅱ、95％、90％、80％、70％各5分钟，每道可以稍微沥干；然后蒸馏水洗3次，每次5min；(3)细胞核染色：使组织块周围水分吸干，将载玻片放入盛有苏木精的5片染色杯中，完全浸没载玻片，室温静置8min；(4)返蓝：准备盛有自来水的十片染缸中，将苏木精冲洗后，将载玻片放置20min，细胞核将逐渐变为蓝色，镜下观察待蓝色明显后进行下一步；(5)细胞浆染色：使组织块周围水分吸干，将载玻片放入盛有伊红的染色杯中，完全浸没载玻片，室温静置3min，显微镜下观察细胞浆红色适宜即可；(6)透明：用镊子夹取载玻片依次于70％、80％、90％、95％的乙醇中快速润洗，然后在100％的无水乙醇ⅰ、ⅱ中分别静置1min、3min；将载玻片从100％无水乙醇ⅱ中取出，稍微沥干后于二甲苯ⅰ静置5min和ⅱ中静置8min；(7)封片：取出载玻片，擦干二甲苯，水平放置，在载玻片一侧滴加适量中性树脂，用镊子取盖玻片从树脂一侧缓慢放下直至组织块全部被封闭；所有操作步骤中保持组织块湿润。
35.masson三色染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水（同前）；（2）按福州迈新masson三色染色试剂盒说明书操作，滴加一滴masson复合染色液（试剂a）于切片上染色5 min，流水冲洗干净；（3）滴加一滴鳞目酸（试剂c）染色5 min，甩干；（4）直接滴加一滴苯胺蓝（试剂d）染色5 min，流水冲洗；（5）滴加一滴分化液（试剂b），分化30~60 s，2次；（6）梯度酒精脱水（75％乙醇
→
85％乙醇
→
95％乙醇
→
无水乙醇）各2 min；（7）二甲苯透明，2 min/次，共两次；（8）中性树胶封片，晾干避光储存，拍照。
36.以上结果表明过表达circ_0098181可抑制肝纤维化，揭示circ_0098181在临床上有作为干预措施缓解肝纤维化的进展，达到逆转肝纤维化的目的。将肝组织切片进行he染色，对结果进行观察发现，ccl4组小鼠肝脏细胞外基质、胶原纤维明显增多，肝纤维化程度明显，而过表达circ_0098181+ccl4组的纤维化程度明显缓解，与ccl4组相比小鼠肝脏细胞外基质、胶原纤维明显减少。
37.基因特异引物的上游引物：tgttgacaccttgaagcagag；(seq id no.1)基因特异引物的下游引物：catctgcttccccatacgga。(seq id no.2)全部序列：gatgtcttccaagcgaccagcctctccgtatggggaagcagatggagaggtagccatggtgacaagcagacagaaagtggaagaagaggagagtgacgggctcccagcctttcaccttcccttgcatgtgagttttcccaacaagcctcactctgaggaatttcagccagtttctctgctgacgcaagagacttgtggccataggactcccacttctcagcacaatacaatggaagttgatggcaataaagttatgtcttcatttgccccacacaactcatctacctcacctcagaaggcagaagaaggtgggcgacagagtggcgagtccttgtctagtacagccctgggaactcctgaacggcgcaagggcagtttagctgatgttgttgacaccttgaagcagaggaaaatggaagagctcatcaaaaacgagccggaag。(seq id no.3)