1.本发明属于降血压产品的制备技术领域，具体涉及一种降血压水产品活性肽的制备方法。
背景技术：
2.高血压作为中风的危险性因素之一，影响着全球20％-45％的人口，尤其是50％-60％的老年人。血管紧张素-i-转换酶(ec 3.4.15.1；ace)是一种金属羧肽酶，可调节肾素-血管紧张素系统中的血压，它水解血管紧张素i羧基末端二肽his-leu以获得血管紧张素ii，血管紧张素ii增强心肌的收缩力，导致血管平滑肌收缩和血压升高，因此，抑制ace活性是降血压的重要手段。人工合成的血管紧张素转换酶(ace)抑制剂会产生副作用，如：过敏反应、肾衰竭等，因此，他们不适合长期服用。从动物蛋白中提取的天然降血压肽因环保、可持续、低成本、无毒副作用等优点而受到世界各国的广泛关注。从生物资源可持续开发利用的角度看，动物加工过程中产生的副产物或废弃物中的蛋白质资源具有很大的生物活性肽生产潜力。
3.然而，目前天然来源的血管紧张素转换酶(ace)抑制肽的效果还有待提高，其在体内的稳定性较差、易被胃肠道中的酶水解，不能很好的发挥其降血压功效。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，该方法得到的产物对血管紧张素转化酶(ace)的抑制效果好。
5.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
6.步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
7.1)粗多肽的制备：
8.300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物离心，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
9.2)多肽的分离、纯化：
10.将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
11.步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得
到ace抑制肽ylrlhf；
12.步骤3、将纳米级材料为溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
13.所述纳米级材料为：纳米级氧化石墨烯(go)、羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)、聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)、羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)；
14.步骤4、10倍纳米级材料为质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍纳米级材料为质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
15.步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：纳米级材料的质量分数为1-2:2-1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应6h，得到反应液；
16.步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-nano粉末)。
17.按照上述技术方案，步骤1的粗多肽的制备中水解产物离心为：水解产物在离心条件为10000g下离心20min。
18.按照上述技术方案，所述步骤5中，按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：纳米级材料的质量分数最佳为1:2-2:1。
19.本发明采用“粗多肽的制备”工艺条件(超高压处理、胃蛋白酶)的作用:超高压可以使蛋白质结构更松散，通过改变氢键和离子键等非共价键等非共价键暴露更多的切割位点。同时，超高压很容易通过二硫键诱导蛋白质聚集。因此，蛋白质对酶的敏感性发生了变化。胃蛋白酶是一种内切酶，优先裂解c端芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)残基。因此，用胃肠道蛋白水解酶获得的水解物具有更高的血管紧张素转换酶抑制活性是由于用胃蛋白酶水解物释放了更多具有c端芳香族氨基酸残基的肽。
20.本发明采用“多肽的分离纯化”的作用：粗多肽中成分复杂，为了解具体的起到ace抑制作用的多肽及其作用机理。
21.本发明采用“10倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中”的作用：氧化石墨烯与多肽的结合需要用到edcl和nhs作为引发剂来激活纳米粒子的羧基基团。
22.为解决天然来源的血管紧张素转换酶(ace)抑制肽的效果，本发明将纳米级氧化石墨烯(go)负载ace抑制肽ylrlhf(活性肽ylrlhf)，纳米材料具有尺寸小、比表面积大、渗透性强等独特的物理化学性质，可以有效地增强ace抑制肽在的降血压效果和在体内的稳定性，提高ace抑制肽的生物利用率。氧化石墨烯(graphene oxide，go)、二氧化硅(sio2)、金纳米粒子(gold nanoparticles)、羧基功能化的四氧化三铁(fe3o4)、氧化锌(zno)、二氧化钛(tio2)、壳聚糖等纳米粒子是负载ace抑制肽的潜在材料。
23.未与go结合的多肽在0.1mg/ml时，ace抑制率为43.36％，与go结合后的抑制率分别为46.75％(肽：go＝1:2)、51.72％(肽：go＝1:1)、52.44％(肽：go＝2:1)。
24.本发明的有益效果是：本发明方法利用纳米材料负载活性肽ylrlhf，与未负载纳米材料的活性肽进行对比，当样品浓度为均为0.1mg/ml时，血管紧张素转换酶(ace)抑制率提升了19.23％，同时负载纳米粒子能增强活性肽ylrlhf在胃肠道中的稳定性。说明经过纳
米材料负载后的活性肽的降血压效果、稳定性优于未负载纳米粒子的活性肽的。为血管紧张素转化酶(ace)抑制肽的相关研究提供一定的技术支撑。
具体实施方式
25.为了使本发明的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.ace抑制率的测定方法：
27.反应液含有30μl ace(0.1u/ml)、40μl的肽和80μl的n-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-l-苯丙氨酰-甘氨酸(fapgg)(1mmol/l)。空白对照样品包括30μl ace(0.1u/ml)、80μl的fapgg和40ml pbs(80mmol/l ph＝8.2)。预反应混合物在340nm处的吸光度由多功能微板测试仪测量。混合物在37℃下摇晃30min后，再次测量反应后混合物的吸光度。ace抑制活性根据以下公式计算。
[0028]
ace抑制活性(％)＝(1-δa2/δa1)
×
100％，
[0029]
δa1：空白对照在30min内的吸光度变化；δa2：反应样品在30min内的吸光度变化。
[0030]
实施例1：
[0031]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0032]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0033]
1)粗多肽的制备：
[0034]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0035]
2)多肽的分离、纯化：
[0036]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0037]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0038]
步骤3、将纳米级氧化石墨烯(go)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0039]
步骤4、10倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0040]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：纳米级氧化石墨烯(go)的质量分数为1:2，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应6h，得到反应液；
[0041]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-go粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为46.75％(肽：go＝1:2)。
[0042]
实施例2：
[0043]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0044]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0045]
1)粗多肽的制备：
[0046]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0047]
2)多肽的分离、纯化：
[0048]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0049]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0050]
步骤3、将纳米级氧化石墨烯(go)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0051]
步骤4、10倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0052]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：纳米级氧化石墨烯(go)的质量分数为1:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应6h，得到反应液；
[0053]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-go粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为51.72％(肽：go＝1:1)。
[0054]
实施例3：
[0055]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0056]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0057]
1)粗多肽的制备：
[0058]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0059]
2)多肽的分离、纯化：
[0060]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0061]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0062]
步骤3、将纳米级氧化石墨烯(go)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0063]
步骤4、10倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍纳米级氧化石墨烯(go)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0064]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：纳米级氧化石墨烯(go)的质量分数为2:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应6h，得到反应液；
[0065]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-go粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为52.44％(肽：go＝2:1)。
[0066]
实施例4：
[0067]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0068]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0069]
1)粗多肽的制备：
[0070]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0071]
2)多肽的分离、纯化：
[0072]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0073]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0074]
步骤3、将羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0075]
步骤4、10倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0076]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)的质量分数为1:2，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应10h，得到反应液；
[0077]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-si粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为50.24％(肽：cmsn＝1:2)。
[0078]
实施例5：
[0079]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0080]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0081]
1)粗多肽的制备：
[0082]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0083]
2)多肽的分离、纯化：
[0084]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0085]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0086]
步骤3、将羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0087]
步骤4、10倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0088]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)的质量分数为1:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应10h，得到反应液；
[0089]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-si粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为52.29％(肽：cmsn＝1:1)。
[0090]
实施例6：
[0091]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0092]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0093]
1)粗多肽的制备：
[0094]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0095]
2)多肽的分离、纯化：
[0096]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0097]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台(北京)通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0098]
步骤3、将羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0099]
步骤4、10倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0100]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基介孔二氧化硅纳米颗粒(carboxyl mesoporous silica nanoparticles，cmsn)的质量分数为2:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应10h，得到反应液；
[0101]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-si粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为62.55％(肽：cmsn＝2:1)。
[0102]
实施例7：
[0103]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0104]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0105]
1)粗多肽的制备：
[0106]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0107]
2)多肽的分离、纯化：
[0108]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组
氨酸-苯丙氨酸)；
[0109]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台(北京)通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0110]
步骤3、将聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0111]
步骤4、10倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0112]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)的质量分数为1:2，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应8h，得到反应液；
[0113]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-au粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为51.37％(肽：gn-p＝1:2)。
[0114]
实施例8：
[0115]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0116]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0117]
1)粗多肽的制备：
[0118]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0119]
2)多肽的分离、纯化：
[0120]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0121]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0122]
步骤3、将聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0123]
步骤4、10倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0124]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修
饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)的质量分数为1:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应8h，得到反应液；
[0125]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-au粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为58.62％(肽：gn-p＝1:1)。
[0126]
实施例9：
[0127]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0128]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0129]
1)粗多肽的制备：
[0130]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0131]
2)多肽的分离、纯化：
[0132]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0133]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0134]
步骤3、将聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0135]
步骤4、10倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0136]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：聚乙二醇包裹金纳米粒子(末端羧基修饰)(gold nanoparticles-peg-n3，gn-p)的质量分数为2:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应8h，得到反应液；
[0137]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-au粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为59.71％(肽：gn-p＝2:1)。
[0138]
实施例10：
[0139]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0140]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0141]
1)粗多肽的制备：
[0142]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0143]
2)多肽的分离、纯化：
[0144]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0145]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0146]
步骤3、将羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0147]
步骤4、10倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0148]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)的质量分数为1:2，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应4h，得到反应液；
[0149]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-fe粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为53.41％(肽：dmsa@fe3o4＝1:2)。
[0150]
实施例11：
[0151]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0152]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0153]
1)粗多肽的制备：
[0154]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0155]
2)多肽的分离、纯化：
[0156]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0157]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得
到ace抑制肽ylrlhf；
[0158]
步骤3、将羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0159]
步骤4、10倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0160]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)的质量分数为1:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应4h，得到反应液；
[0161]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-fe粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml时，测得抑制率为64.91％(肽：dmsa@fe3o4＝1:1)。
[0162]
实施例12：
[0163]
一种高效降血压水产品活性肽的制备方法，包括以下步骤：
[0164]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解超高压处理后的鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf；具体步骤如下：
[0165]
1)粗多肽的制备：
[0166]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，得到超高压处理后的鳙鱼肉；按超高压处理后的鳙鱼肉：水的质量比＝1：5，在超高压处理后的鳙鱼肉中加入水(调节ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在离心力为10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0167]
2)多肽的分离、纯化：
[0168]
将粗多肽使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0169]
步骤2、利用peppowertm多肽合成平台通过固相合成法合成了多肽序列ylrlhf，得到ace抑制肽ylrlhf；
[0170]
步骤3、将羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)溶于水超声2h后制备得到0.1mg/ml的分散液；
[0171]
步骤4、10倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edcl)和20倍羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)质量分数的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)加入到分散液中，并搅拌5min；
[0172]
步骤5、按步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf：羧基功能化的四氧化三铁(dmsa@fe3o4)的质量分数为2:1，再加入步骤2得到的ace抑制肽ylrlhf，混合均匀后磁力搅拌器上反应4h，得到反应液；
[0173]
步骤6、将步骤5得到的反应液离心，沉淀物用超纯水洗涤3次，冷冻干燥后得到高效降血压水产品活性肽(或称：有高ace抑制活性的rvpsl-fe粉末)。当样品浓度为0.1mg/ml
时，测得抑制率为65.87％(肽：dmsa@fe3o4＝2:1)。
[0174]
对比例：
[0175]
步骤1、利用胃蛋白酶酶解鳙鱼肉得到粗多肽，将粗多肽进行分离、纯化、鉴定后得到ace抑制肽ylrlhf；具体步骤如下：
[0176]
1)粗多肽的制备：
[0177]
300mpa超高压处理鳙鱼肉20min，在处理后的鳙鱼肉中加入一定量的水(ph＝3)，加入4000μ/g的胃蛋白酶，在55℃水浴下反应6h；95℃水浴中加热10min终止反应，水解产物在10000g下离心20min，收集上清液利用透析袋(md77-5m)透析除盐即为粗多肽；
[0178]
3)多肽的分离、纯化：
[0179]
将粗多肽溶液使用装有5kda截留超滤膜的超滤杯超滤，膜压力为0.05mpa，得到分子量《5kda和》5kda的两个级分，《5kda被冻干后利用质谱测定氨基酸序列，选取置信值＞99％的肽段通过peptideranker软件进行活性评分，对评分结果＞0.5的肽段进行分子对接，根据分子对接结果筛选出ace潜在活性最大的肽段ylrlhf(酪氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-组氨酸-苯丙氨酸)；
[0180]
步骤2、通过固相合成方式制备98％纯度的ace抑制肽ylrlhf，液相及质谱检测多肽纯度及分子量；
[0181]
步骤3、配制0.1mg/ml的多肽溶液(ylrlhf)，测定ace抑制率。当样品浓度为0.1mg/ml时，对比例的抑制率为43.36％。