一种花生过敏诊断的标志物、试剂盒

1.本发明属于免疫分子生物学技术领域，尤其涉及一种花生过敏诊断标志物、试剂盒。


背景技术：

2.作为当前世界重大的公共卫生问题之一，近年来随着食物的多样化以及人们生活方式的改变，食物过敏发生率逐年上升，被称为继哮喘之后的第二波过敏流行病。流行病学调查显示，食物过敏在成人中的患病率约为2％，在儿童中高达8％。花生过敏作为最严重的食物过敏之一，一般不随着年龄增长而消失，仅微量过敏原便可引发严重的过敏反应，主要表现在皮肤、呼吸道和消化道，如瘙痒、血管神经性水肿、鼻结膜炎、哮喘和腹泻等，严重时可出现全身性反应，如过敏性休克等。
3.食物过敏是机体免疫系统对食物蛋白产生的不良免疫反应，典型的食物过敏反应机制由ige介导，导致肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎性介质。近年来研究逐渐发现长链非编码rna广泛参与人体几乎所有的生理、病理活动，参与、调控或介导疾病的发生发展过程。长链非编码rna是指长度》200nt且不具备蛋白编码能力的一种rna，约占人体总rna的98％。长链非编码rna分子内部具有特定而复杂的二级空间结构，能与蛋白质、dna和rna相互作用，可在表观遗传水平、转录水平、转录后水平和蛋白质代谢等多种层面调控基因的表达，其表达紊乱与人类多种疾病的发生发展有密切的联系。目前已经证明了一些长链非编码rna在包括哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病的作用，表明其可以作为过敏性疾病的治疗靶点和生物标志物。但目前关于长链非编码rna在花生过敏中的作用还未见报道。
4.临床上通过食物激发、皮肤点测等体内方法联合血清sige的检测进行食物过敏的确证，但这些方法往往会过度诊断食物过敏。随着分子生物学、蛋白组学和基因组学的不断发展，研究人员提出了可能辅助食物过敏诊断的新型标志物，目前临床需要一个由多指标组成的诊断模型来综合预测食物过敏的发生。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种花生过敏诊断标志物、试剂盒；通过本发明提供的花生过敏诊断标志物、试剂盒以及诊断模型检测花生过敏具有较好的敏感度和特异度，能够替代传统的方法进行花生过敏的确证，消除体内检测方法的侵入性和相关风险，确保能够辅助花生过敏诊断，综合预测食物过敏的发生，为花生过敏的诊断、治疗提供新的思路。
6.本发明提供了一种花生过敏诊断标志物，包括长链非编码rna ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965和ensrnot00000081904中的一种或几种。
7.本发明提供了一种检测花生过敏的试剂盒，包括检测所述的长链非编码rna ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965和ensrnot00000081904
ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965和ensrnot00000081904表达量的试剂。
27.在本发明中，所述试剂包括扩增长链非编码rna ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965和ensrnot00000081904的引物；
28.其中，ensrnot00000087227的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；具体如下：
29.f1：acatcgtttcttggcaaccg(seq id no.1)；
30.r1：aaaagctgaaccacgcttcc(seq id no.2)
31.ensrnot00000090335的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；具体如下：
32.f2：gcagccttgaaactgtcttctg(seq id no.3)
33.r2：tcagccattgtggaagaagc(seq id no.4)
34.ensrnot00000085965的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；具体如下：
35.f3：tgacttgcagcatgatcacc(seq id no.5)
36.r3：ttgaaagcgcctgtgtgaag(seq id no.6)
37.ensrnot00000081904的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；具体如下：
38.f4：aggaatttctctgccgaccg(seq id no.7)
39.r4：gtaaccctggttctgacccg(seq id no.8)。
40.在本发明中，所述引物的使用浓度独立优选为8～12μm，进一步优选为9～11μm，更进一步优选为10μm。
41.在本发明中，所述检测花生过敏的试剂盒优选的还包括实现长链非编码rna扩增的其他试剂；包括但不限于市售的实时荧光定量pcr扩增缓冲液、内参基因引物和ddh2o。在本发明具体实施过程中，所述试剂盒还包括内参基因b-actin的扩增引物；具体引物序列如下：
42.f5：aagtgtgacgttgacatccgtaaag(seq id no.9)
43.r5：cagctcagtaacagtccgcctaga(seq id no.10)。
44.在本发明中，所述扩增的体系以20μl计，优选的包括以下组分：2
×
taq pro universal sybr qpcr master mix 10μl，上游引物0.4μl、下游引物0.4μl，cdna 1μl，ddh2o 8.2μl。
45.在本发明中，所述扩增的程序优选的如下：预变性95℃ 30s；变性95℃ 3～10s，退火60℃ 10～30s；熔解曲线95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。
46.在本发明中，通过lncrna测序得到花生过敏大鼠和对照大鼠的血液lncrna表达谱，筛选出差异表达的lncrnas；然后以获得的差异表达的lncrnas进行回归，构建诊断模型；具体的利用lasso回归的glmnet函数，逻辑回归的lrm函数构建获得诊断模型；诊断模型如下：y＝38.5719
×
ensrnot00000087227+313.8883
×
ensrnot00000090335+51.874
×
ensrnot00000085965-60.5057
×
ensrnot00000081904-8.9084，其中，
△
ct＝ct
目的基因-ct
内参基因
；计算y值，当y值》0时，判定为花生过敏阳性，反之则为阴性。
47.表1基于lncrna的诊断公式系数
[0048][0049]
在本发明所述试剂盒具体使用过程中，优选的包括以下步骤：
[0050]
s1)提取待检测样本血液中的rna；
[0051]
s2)对提取的rna进行反转录获得cdna；
[0052]
s3)以获得的cdna为模板进行长链非编码rna的定量pcr扩增；
[0053]
s4)获得待检测样本中目的长链非编码rna的表达量相对于内参基因β-actin变化的表达倍数2
‑△
ct
，带入上述诊断模型，确定待检测样本是否为花生过敏。
[0054]
在本发明中，提取待检测样本血液中的rna使用trizol rna提取试剂(invitrogen，america)；cdna的合成使用hiscript iii rt supermix for qpcr(vazyme，china)进行；使用taq pro universal sybr qpcr master mix(vazyme，china)，按照试剂说明规定的操作方法进行实时荧光定量pcr。
[0055]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0056]
实施例1
[0057]
bn大鼠花生过敏模型构建
[0058]
如图1所示，利用市售bn大鼠建立花生过敏模型，在21天激发后通过测量体温、血清中ige、igg1、ifn-γ、il-4、组胺、mmcp-1的浓度来确认花生过敏模型建立成功，具体的将bn大鼠分为花生过敏组和阴性对照两组，各包括24、15只大鼠。实验开始第1、3、5、15天花生过敏组腹腔注射4mg/ml花生蛋白(以pbs为溶剂)，阴性对照组腹腔注射pbs各500ml。在第21天时进行5倍剂量(20mg/ml)的花生蛋白/pbs激发，测量体温，用6.5％的水合氯醛麻醉，眼眦采血1ml，迅速加入3ml trizol，通过涡旋或用移液器吹打混匀，迅速置于液氮中，并转移至-80℃保存备用。大鼠采血后脱颈处死。
[0059]
结果如图2～4所示，花生过敏组和对照组血清中的ige、igg1、组胺、mmcp-1、il-4、ifn-γ均存在显著差异，模型构建成功。
[0060]
实施例2
[0061]
以实施例1制备的大鼠血液为原料进行血液rna提取
[0062]
1.在-80℃冰箱取出1ml血液样本，冰上融化。
[0063]
2.加入200ml氯仿，盖紧离心管盖，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。
[0064]
3. 12,000rpm 4℃离心15min。小心吸取上层水相至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。
[0065]
4. 12,000rpm 4℃离心10min。小心弃去上清，加入1mldepc水配置的75％乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。
[0066]
5. 12,000rpm 4℃离心3min，弃去上清。室温放置2-3min，晾干。加入30ml rnase free water，待完全溶解后，取少量检测浓度和纯度，其余在-80℃保存。
[0067]
实施例3
[0068]
1.cdna合成
[0069]
利用hiscript iii rt supermix for qpcr(vazyme，china)对实施例2提取的rna进行反转录。
[0070]
1)去除基因组dna
[0071]
在rnase-free离心管中配置如下混合液：
[0072]
表2基因组去除反应体系
[0073]
混合液体积rnase-free ddh2oto 16μl4
×
gdna wiper mix4μl模板rna1mg
[0074]
用移液器轻轻吹打混匀，42℃ 2min。
[0075]
2)在第一步的反应管中直接加入5
×
hiscript iii qrt supermix，用移液器轻轻吹打混匀。
[0076]
表3 cdna合成反应体系
[0077]
混合液体积第一步的反应液16μl5
×
hiscript iii qrt supermix4μl
[0078]
3)进行逆转录反应
[0079]
表4 cdna合成反应程序
[0080][0081][0082]
2.引物设计
[0083]
根据长链非编码rna转录本序列，通过primer3plus在线设计引物，引物序列如下所示：
[0084]
ensrnot00000087227：
[0085]
f1：acatcgtttcttggcaaccg(seq id no.1)；
[0086]
r1：aaaagctgaaccacgcttcc(seq id no.2)
[0087]
ensrnot00000090335：
[0088]
f2：gcagccttgaaactgtcttctg(seq id no.3)
[0089]
r2：tcagccattgtggaagaagc(seq id no.4)
[0090]
ensrnot00000085965：
[0091]
f3：tgacttgcagcatgatcacc(seq id no.5)
[0092]
r3：ttgaaagcgcctgtgtgaag(seq id no.6)
[0093]
ensrnot00000081904：
[0094]
f4：aggaatttctctgccgaccg(seq id no.7)
[0095]
r4：gtaaccctggttctgacccg(seq id no.8)。
[0096]
b-actin
[0097]
f5：aagtgtgacgttgacatccgtaaag(seq id no.9)
[0098]
r5：cagctcagtaacagtccgcctaga(seq id no.10)
[0099]
3.实时荧光定量pcr
[0100]
使用taq pro universal sybr qpcr master mix(vazyme，china)，按照试剂说明规定的操作方法进行实验。
[0101]
1)qpcr反应体系如下：
[0102]
表5 qpcr反应体系
[0103][0104][0105]
2)qpcr反应程序
[0106]
表6 qpcr反应程序
[0107][0108]
4.计算实验结果
[0109]
1)lncrna表达量
[0110]
由pcr反应曲线获得的ct(thresholdcyclenumber，阈值循环数)计算，采用
对目的基因进行定量数据分析，
△
ct＝ct
目的基因-ct
内参基因
，结果如图5所示，ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965、ensrnot00000081904在花生过敏大鼠血液中的表达水平均高于对照组。
[0111]
2)roc诊断效能分析
[0112]
受试者工作特征曲线(roc)和曲线下面积(auc)用于评价血液中4个lncrnas在花生过敏中的诊断价值，结果如图6所示，ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965、ensrnot00000081904的auc值分别为0.8067、0.8433、0.85667、0.8333，均有较好的诊断效能；但当4种lncrna联合分析时，诊断效能明显高于单独lncrna，auc高达0.9433，表明联合血液中的ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965、ensrnot00000081904的表达量能较好的诊断花生过敏。
[0113]
实施例4
[0114]
lncrna诊断效能验证
[0115]
按照附图1所示花生过敏bn大鼠模型，构建花生、牛奶、虾过敏模型(牛奶、虾过敏模型的构建方法与花生过敏模型一致，将致敏物质改为牛奶和虾)，每组各3只，依据如上所述的实验方法，提取血液中的rna，反转录，实时荧光定量pcr得到各lncrna的表达量，依据模型公式进行拟合，计算roc曲线的auc值分别如下表所示，基于4个lncrnas的诊断模型能够区分花生过敏与其他过敏，具有较好的特异性和敏感性。
[0116]
表7 lncrna模型诊断效能评价
[0117][0118]
由上述实施例可知，本发明提供的花生过敏诊断标志物lncrna ensrnot00000087227、ensrnot00000090335、ensrnot00000085965和ensrnot00000081904，具有较好的敏感度和特异度，能够用于花生过敏的确诊。
[0119]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。