一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法、应用与流程

本发明涉及基因工程和酶工程的，尤其涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法、应用。

背景技术：

1、甜菊糖苷是从植物甜叶菊中提取的高甜度、无能量的天然甜味剂，具有纯天然、零卡路里、热稳定、对血糖无影响、非可发酵、酸碱性稳定、比普通糖甜150～300倍、防龋齿、无褐变反应和无脂肪与碳水化合物这十大优点，受到全球消费者与开发者的青睐。甜菊糖苷的主要成分为甜菊苷(stevioside，stev)及瑞鲍迪苷a(rebaudioside a，reba)，但是stev和reba具有较明显的苦后味，通常通过转糖基的方式改善其风味。

2、环糊精葡萄糖基转移酶(cgtase，ec 2.4.1.19)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，gh13_2)，是一种胞外酶，同时也是一种多功能酶，能够以淀粉、甜菊糖苷为底物催化转糖基反应，将甜菊糖苷转化为葡萄糖基甜菊糖苷，相比之下，以reba为底物转化而来的葡萄糖基甜菊糖苷的味质更佳。

3、因此，提升reba的转化率对于葡萄糖基甜菊糖苷的生产和品质提升有重要意义。目前市场上专门用于甜菊糖苷酶改的环糊精葡萄糖基转移酶种类较少，针对reba转化率提升的方法更是鲜见报道。

技术实现思路

1、为了解决如何提高reba的转化率以及提升葡萄糖基甜菊糖苷味质的技术问题，本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法、应用，通过环糊精葡萄糖基转移酶的第199位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，能够在reba转化为葡萄糖基甜菊糖苷的反应中，提高reba的转化率，并且提升葡萄糖基甜菊糖苷味质。

2、本发明的具体技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体为：将氨基酸序列如seq id no.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第199位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，命名为y199f，氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于alkalihalobacillus oshimensis。

5、第二方面，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、第三方面，携带所述基因的表达载体。

7、作为优选，所述表达载体为pgex质粒、phy300质粒、ppic3k质粒、ppic9k质粒、phy300plk质粒、pet质粒或duet质粒。

8、作为优选，所述pet质粒选自pet-15质粒、pet-19质粒、pet-20质粒、pet-24质粒、pet-28质粒或pet-32质粒；所述duet质粒选自prsfduet-1质粒或pacycduet-1质粒；所述pgex质粒选自pgex-4t-2质粒或pgex-6p质粒。

9、第四方面，携带所述基因或所述表达载体的微生物细胞。

10、作为优选，所述微生物细胞为细菌细胞或真菌细胞。

11、作为优选，所述微生物细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

12、作为优选，所述微生物细胞的构建方法为：将携带所述基因的重组表达载体通过电击或化学转化法转入宿主细胞。

13、第五方面，一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建方法，将微生物细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，从离心获得的发酵上清液或菌体中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

14、第六方面，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在制备葡萄糖基甜菊糖苷上的应用。

15、第七方面，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在提高环糊精葡萄糖基转移酶将莱苞迪苷a转化为葡萄糖基甜菊糖苷的转化率上的应用。

16、作为优选，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体对reba的转化率由reba的减少量来测定，具体方法为：将上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体或上述微生物细胞添加至含有淀粉和甜菊糖苷的反应体系中进行反应。

17、与现有技术对比，本发明的有益效果是：如图4和图5所示，分子对接结果表明，与突变前相比，y199f突变体能够与reba结合形成较佳构象，此时的结合能更低，并且该构象下参与形成氢键的氨基酸更多，推测能够起到双重作用，进一步促进reba的转化；实验结果也表明，通过环糊精葡萄糖基转移酶的第199位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，制备得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其能够在reba转化为葡萄糖基甜菊糖苷的反应中，将reba的转化率由64.8％提升到72.5％。

技术特征：

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seqid no.2所示。

2.编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.如权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体为pgex质粒、phy300质粒、ppic3k质粒、ppic9k质粒、phy300plk质粒、pet质粒或duet质粒。

5.携带权利要求3所述基因或权利要求4或5所述表达载体的微生物细胞。

6.如权利要求5所述微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为细菌细胞或真菌细胞。

7.一种如权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建方法，其特征在于，将权利要求5或6所述微生物细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，从离心获得的发酵上清液或菌体中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在制备葡萄糖基甜菊糖苷上的应用。

9.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在提高环糊精葡萄糖基转移酶将莱苞迪苷a转化为葡萄糖基甜菊糖苷的转化率上的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程和酶工程的技术领域，公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法、应用，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第199位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，命名为Y199F，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明制备得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其能够在RebA转化为葡萄糖基甜菊糖苷的反应中，将RebA的转化率由64.8%提升到72.5%。

技术研发人员：张睿钦,唐瑞琪,武文慧,曲茂华,刘冠辰,李言郡,沈珊珊
受保护的技术使用者：杭州娃哈哈科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13