一种AFA衍生物的制备方法及其应用与流程

一种afa衍生物的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种afa衍生物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，fda共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。
3.抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。
4.双吲哚生物碱是一类含有两个吲哚基团的天然产物，代表化合物为具有抗肿瘤活性的蝴蝶霉素(rebeccamycin)。蝴蝶霉素是一种来源于放线菌的天然产物，具有强效的拓扑异构酶和激酶抑制活性。开发双吲哚生物碱类似物的有效合成技术，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。
5.蝴蝶霉素的生物合成基因簇dna序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如rebo、rebd、rebp、rebc等的催化活性在体外生化实验中得到证实，基于已鉴定的蝴蝶霉素的生物合成途径酶系，研究人员在异源宿主白色链霉菌(streptomyces albus)体内实现了多个双吲哚生物碱类似物(蝴蝶霉素合成中间体)的生物合成，例如，以色氨酸为起始使用酶组合rebo，rebd，rebp和rebc实现了arcyriaflavin a(afa)的合成。
6.afa作为一种重要的药物中间体，其本身也具有激酶抑制活性，也具有较多的激酶作用靶点，然而关于激酶靶点，本领域有两个方面亟待研究进步：第一方面，人体包含518个激酶，其中大部分激酶还缺失有效的活性抑制剂，因此有必要开发新的激酶抑制剂。第二方面，本领域公知，靶点越多，其毒性往往越强，而且基于目前药物领域逐渐趋于特异性作用的研究趋势，如何筛选出只针对一种或两种激酶作用的抑制剂，将对于制备特异性好、毒性小的抗癌药物具有重要的意义。
7.为解决这一问题，本发明首次提出从afa的衍生物入手，提供一种快速、方便、低成本合成afa的衍生物的方法，并从这些衍生物中筛选得到具有新的激酶靶点，或激酶抑制特异性好(1-2个靶点)的化合物来作为药物合成中间体，对于新型、特异性好、毒性小的抗癌药物的筛选和研发而言具有重要的意义。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种afa衍生物的制备方法及其应用。
9.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种afa衍生物的制备方法，所述afa衍生物的结构为
11.所述r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自独立地选自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一种，且其中至少一种不为h；
12.所述制备方法包括：将重组质粒转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，活化后，将菌株、培养基、诱导剂与原料化合物混合，诱导培养，得发酵液，萃取，即得所述afa衍生物；
13.所述重组质粒携带编码l-色氨酸氧化酶vioa、cpa合成酶viob、单加氧酶rebp和单加氧酶rebc的核苷酸序列；
14.所述原料化合物的结构为
15.所述r9、r
10
、r
11
和r
12
各自独立地选自h、ch3、oh、och3、f、cl、br、nh2、cn或no2中的任意一种，且其中至少一种不为h。
16.特别说明，本技术采用所述方法对于具有上述结构的afa衍生物都成功合成了，由于暂未进行激酶抑制活性的测试或测试结果不理想，因此未展示所有化合物的具体结果。本领域技术人员应当知晓，采用本技术提供的方法对于具有上述结构的afa衍生物来说均适用。
17.优选地，所述afa衍生物选自4f-afa、4,4'f-afa、5f-afa、5,5'f-afa、5br-afa、5,5’br-afa、7cl-afa或7,7’cl-afa中的任意一种，分别依次对应如下结构：
[0018][0019]
所述原料化合物具有任意一种如下结构：
[0020][0021]
优选地，所述重组质粒包括petduet系列、pacycduet系列、prsfduet系列、pcoladuet或pcdfduet系列表达载体中的任意一种。
[0022]
优选地，所述重组质粒包括pcdfduet-1_vioaviobrebprebc。
[0023]
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21(de3)。
[0024]
优选地，所述培养基包括m9培养基。
[0025]
选择m9培养基是因为其中中不含色氨酸，可避免afa的产生。
[0026]
优选地，所述诱导剂包括iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)。
[0027]
优选地，所述iptg的加入量为0.3-0.5mm，例如0.3mm、0.32mm、0.35mm、0.37mm、0.4mm、0.42mm、0.45mm、0.47mm、0.5mm等。
[0028]
优选地，所述原料化合物的加入量为3-5mm，例如3mm、3.2mm、3.5mm、3.7mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.7mm、5mm等。
[0029]
优选地，所述诱导培养的温度为15-25℃，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃等，所述诱导培养的时间为36-48h，例如36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h等。
[0030]
优选地，所述活化包括：将重组大肠杆菌接种至lb培养基中进行活化培养。
[0031]
优选地，所述活化培养的温度为33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
[0032]
优选地，所述萃取中使用的萃取试剂包括乙酸乙酯。
[0033]
优选地，所述萃取在15-40℃下进行，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
[0034]
优选地，所述萃取前还包括对发酵液进行加热，所述加热的温度为80-90℃，例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃等，所述加热的时间为10-20min，例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
[0035]
第二方面，本发明提供如第一方面所述的afa衍生物的制备方法或由所述制备方法得到的afa衍生物在制备抗癌药物中的应用。
[0036]
第三方面，本发明提供如第一方面所述的afa衍生物的制备方法或由所述制备方法得到的afa衍生物在制备激酶抑制剂中的应用。
[0037]
优选地，所述激酶抑制剂包括flt3itd抑制剂、pim1抑制剂、pim3抑制剂、map4k3抑制剂、irak4抑制剂、pak1抑制剂或cdk7/cych/mat1抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0038]
优选地，当所述afa衍生物为4f-afa时，所述激酶抑制剂为flt3itd抑制剂、pim1抑制剂、pim3抑制剂、map4k3抑制剂、irak4抑制剂或pak1抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0039]
优选地，当所述afa衍生物为7cl-afa时，所述激酶抑制剂为flt3itd抑制剂和/或pim1抑制剂。
[0040]
优选地，当所述afa衍生物为5br-afa时，所述激酶抑制剂为flt3itd抑制剂和/或pim1抑制剂。
[0041]
优选地，当所述afa衍生物为7,7’cl-afa时，所述激酶抑制剂为cdk7/cych/mat1抑制剂和/或pim1抑制剂。
[0042]
优选地，当所述afa衍生物为5f-afa时，所述激酶抑制剂为flt3itd抑制剂、pim1抑制剂或pim3抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0043]
优选地，当所述afa衍生物为5,5'f-afa时，所述激酶抑制剂为flt3itd抑制剂。
[0044]
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
[0045]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0046]
本发明首次提出从afa的衍生物入手，提供一种快速、方便、低成本合成afa的衍生物的方法(生物合成方法)，并从这些衍生物中筛选得到具有新的激酶靶点，或激酶抑制特异性好(1-2个靶点)的化合物来作为药物合成中间体，对于新型、特异性好、毒性小的抗癌药物的筛选和研发而言具有重要的意义。
[0047]
具体地，本发明采用所述方法合成了8种afa衍生物：4f-afa、4,4'f-afa、5f-afa、5,5'f-afa、5br-afa、5,5’br-afa、7cl-afa和7,7’cl-afa，各产物之间可以相互分离，且不受其他物质干扰，纯度高，产量高，合成方法快速、方便、低成本。
[0048]
其中，4f-afa具有抑制map4k3、irak4、pak1的活性，7cl-afa具有抑制cdk7/cych/mat1的活性，这些活性都是afa不具备的，此结果令人惊喜。这些衍生物可用于制备map4k3、irak4、pak1、cdk7/cych/mat1抑制剂或以这些激酶为靶点的抗癌药物。
[0049]
7,7’cl-afa与5br-afa仅有两个激酶靶点，因此在特异性、毒性方面相较于afa(4个激酶靶点)具有显著优势。特别地，5,5'f-afa仅对flt3itd有抑制活性，可用作flt3itd的
特异性抑制剂，具有重要的应用价值。
附图说明
[0050]
图1为实施例1中所得产物的lc/ms检测图谱，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，3.196min和3.310min处的蜂分别对应4,4’f-afa和4f-afa；b为产物中质荷比(m/z)为342(m-1)的离子图谱，对应4f-afa；c为产物中质荷比(m/z)为360(m-1)的离子图谱，对应4,4’f-afa。
[0051]
图2为实施例1中lc/ms检测图谱中4f-afa(3.310min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0052]
图3为实施例2中所得产物的lc/ms检测图谱，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，3.791min和3.893min处的蜂分别对应5f-afa和5,5’f-afa；b为产物中质荷比(m/z)为342(m-1)的离子图谱，对应5f-afa；c为产物中质荷比(m/z)为360(m-1)的离子图谱，对应5,5’f-afa。
[0053]
图4为实施例2中lc/ms检测图谱中5f-afa(3.791min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0054]
图5为实施例2中lc/ms检测图谱中5,5’f-afa(3.893min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0055]
图6为实施例3中所得产物的lc/ms检测图谱，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，4.095min和4.406min处的蜂分别对应5br-afa和5,5
‘
br-afa；b为产物中质荷比(m/z)为404(m-1)的离子图谱(对应5br-afa)。
[0056]
图7为实施例3中lc/ms检测图谱中5br-afa(4.095min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0057]
图8为实施例3中lc/ms检测图谱中5,5
‘
br-afa(4.406min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0058]
图9为实施例4中所得产物的lc/ms检测图谱，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，4.132min和4.423min处的蜂分别对应7cl-afa和7,7’cl-afa；b为产物中质荷比(m/z)为358(m-1)的离子图谱(对应7cl-afa)；c为产物中质荷比(m/z)为392(m-1)的离子图谱(对应7,7’cl-afa)。
[0059]
图10为实施例4中lc/ms检测图谱中7cl-afa(4.132min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
[0060]
图11为实施例4中lc/ms检测图谱中7,7’cl-afa(4.423min)紫外吸收峰所对应蜂的全波长扫描图谱。
具体实施方式
[0061]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0062]
以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
[0063]
本发明中涉及的重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc的制备方法为本领域常
规技术手段，例如可参照cn112980864a中的实施例1的方法。
[0064]
本发明所涉及的原料化合物：4f-l-trp、5f-l-trp、5br-l-trp和7cl-l-trp购自苏州爱玛特生物科技有限公司。
[0065]
实施例1
[0066]
将重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc转入大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至含10ml lb培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养。待菌液od600增长至0.6-0.8时，4℃，6000rpm离心取菌泥，加入m9(葡萄—矿物盐)培养基悬浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg诱导酶蛋白表达，同时加入4mm4f-l-trp，温度降至20℃，振荡培养42h。
[0067]
发酵结束后，金属浴85℃加热15min，然后冷却至室温(25℃)加入1倍体积的乙酸乙酯充分混匀进行萃取，37℃，200rpm，30min后离心收集有机相上清，并重复一次。将收集到的有机相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μldmso溶解后进行lc/ms检测。
[0068]
所述大肠杆菌中afa衍生物的合成路径如式ⅰ所示：
[0069][0070]
lc/ms检测结果如图1所示，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，3.196min和3.310min处的蜂分别对应4,4’f-afa和4f-afa(全波长扫描图谱见图2)；b为产
物中m/z为342(m-1)的离子图谱，对应4f-afa；c为产物中质荷比(m/z)为360(m-1)的离子图谱，对应4,4’f-afa。
[0071]
上述结果证实了本实施例成功合成了2种afa衍生物：4f-afa和4,4’f-afa，各衍生物可以相互分离，且不受afa等其他物质干扰。
[0072]
实施例2
[0073]
将重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc转入大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至含10ml lb培养基的试管中，37℃，300rpm振荡培养。待菌液od600增长至0.6-0.8时，4℃，8000rpm离心取菌泥，加入m9(葡萄—矿物盐)培养基悬浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg诱导酶蛋白表达，同时加入3.5mm 5f-l-trp，温度降至22℃，振荡培养40h。
[0074]
发酵结束后，金属浴90℃加热10min，然后冷却至室温加入2倍体积的乙酸乙酯充分混匀进行萃取，37℃，200rpm，30min后离心收集有机相上清，并重复一次。将收集到的有机相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后进行lc/ms检测。
[0075]
所述大肠杆菌中afa衍生物的合成路径如式ⅱ所示：
[0076][0077]
lc/ms检测结果如图3所示，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，3.791min和3.893min处的蜂分别对应5f-afa(全波长扫描图谱见图4)和5,5’f-afa(全波长扫描图谱见图5)；b为产物中质荷比(m/z)为342(m-1)的离子图谱，对应5f-afa；c为产物中质荷比(m/z)为360(m-1)的离子图谱，对应5,5’f-afa。
[0078]
上述结果证实了本实施例成功合成了2种afa衍生物：5f-afa和5,5’f-afa，各衍生物可以相互分离，且不受afa等其他物质干扰。
[0079]
实施例3
[0080]
将重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc转入大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至含10ml lb培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养。待菌液od600增长至0.6-0.8时，
4℃，6000rpm离心取菌泥，加入m9(葡萄—矿物盐)培养基悬浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg诱导酶蛋白表达，同时加入5mm5br-l-trp，温度降至18℃，振荡培养48h。
[0081]
发酵结束后，金属浴80℃加热20min，然后冷却至室温加入1.2倍体积的乙酸乙酯充分混匀进行萃取，37℃，200rpm，30min后离心收集有机相上清，并重复一次。将收集到的有机相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后进行lc/ms检测。
[0082]
所述大肠杆菌中afa衍生物的合成路径如式ⅲ所示：
[0083][0084]
lc/ms检测结果如图6所示，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，4.095min和4.406min处的蜂分别对应5br-afa(全波长扫描结果见图7)和5,5
‘
br-afa(全波长扫描结果见图8)；b为产物中质荷比(m/z)为404(m-1)的离子图谱，对应5br-afa。
[0085]
上述结果证实了本实施例成功合成了2种afa衍生物：5br-afa和5,5
‘
br-afa，各衍生物可以相互分离，且不受afa等其他物质干扰。
[0086]
实施例4
[0087]
将重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc转入大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至含10ml lb培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养。待菌液od600增长至0.6-0.8时，4℃，7000rpm离心取菌泥，加入m9(葡萄—矿物盐)培养基悬浮菌泥，得菌液，并加入0.4mm iptg诱导酶蛋白表达，同时加入3mm7cl-l-trp，温度降至22℃，振荡培养42h。
[0088]
发酵结束后，金属浴88℃加热12min，然后冷却至室温加入1倍体积的乙酸乙酯充分混匀进行萃取，37℃，200rpm，30min后离心收集有机相上清，并重复一次。将收集到的有机相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μl dmso溶解后进行lc/ms检测。
[0089]
所述大肠杆菌中afa衍生物的合成路径如式ⅳ所示：
[0090][0091]
lc/ms检测结果如图9所示，其中a为产物在316nm处的紫外吸收图谱；其中，4.132min和4.423min处的蜂分别对应7cl-afa(全波长扫描结果见图10)和7,7’cl-afa(全
波长扫描结果见图11)；b为产物中质荷比(m/z)为358(m-1)的离子图谱，对应7cl-afa；c为产物中质荷比(m/z)为392(m-1)的离子图谱，对应7,7’cl-afa。
[0092]
上述结果证实了本实施例成功合成了2种afa衍生物：7cl-afa和7,7’cl-afa，各衍生物可以相互分离，且不受afa等其他物质干扰。
[0093]
测试例
[0094]
分别对上述实施例中合成的afa衍生物进行激酶抑制活性测试，同时将afa一并测试，进行对比。该测试委托由上海润诺生物科技有限公司进行，利用mobility shift assay的方法，分别测试待测化合物对于不同种激酶的抑制率，待测化合物的测试浓度为1000nm，单浓度，复孔检测。结果见表1(抑制率为50％以上则认为该化合物对于该激酶有抑制活性，
“‑”
表示低于50％，无抑制活性)。
[0095]
表1
[0096][0097]
结果显示，虽然各待测化合物结构比较接近，但其在激酶的抑制方面差异显著。其中，afa对alk5、flt3itd、pim1和pim3这4种激酶有抑制活性，对表中其他激酶无抑制活性；4f-afa对flt3itd、pim1、pim3、map4k3、irak4、pak1这6种激酶具有抑制活性；7cl-afa对flt3itd和pim1这两种激酶有抑制活性；7,7’cl-afa对cdk7/cych/mat1和pim1这两种激酶有抑制活性；5br-afa对flt3itd和pim1这两种激酶有抑制活性；5f-afa对flt3itd、pim1和pim3这3种激酶具有抑制活性；5,5'f-afa仅对flt3itd有抑制活性。
[0098]
分析以上结果可知：(1)afa衍生物4f-afa具有抑制map4k3、irak4、pak1的活性，其衍生物7cl-afa具有抑制cdk7/cych/mat1的活性，这些活性都是afa不具备的，此结果令人惊喜。
[0099]
(2)7,7’cl-afa与5br-afa仅有两个激酶靶点，因此在特异性、毒性方面相较于afa(4个激酶靶点)具有显著优势。特别地，5,5'f-afa仅对flt3itd有抑制活性，可用作flt3itd的特异性抑制剂，具有重要的应用价值。
[0100]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种afa衍生物的制备方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0101]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0102]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。