广谱、高效吸附并偶联生物矿化去除重金属离子的工程菌

1.本发明涉及属于微生物基因工程及生物矿化领域，更具体地，涉及广谱、高效吸附并偶联生物矿化去除重金属离子的工程菌，尤其涉及一种高效吸附和生物矿化重金属离子的基因工程菌及其构建与应用。


背景技术：

2.科技的发展推动了工农业进程的加快，然而许多含有重金属污染的工农业废水通过各种途径释放到环境中，导致环境中重金属污染问题日益严重。这些重金属会对人体、植物、动物以及微生物造成毒害作用，特别是进入人体后，会引起器官病变和相关疾病的发生，严重危害人类健康，因此，重金属污染修复已成为世界最具挑战性和最为严重的环境问题之一。
3.常规的重金属污染修复方法主要为物理修复和化学修复方法，但是物理化学修复方法也存在着很多问题，例如活性炭吸附方法成本高昂且广谱性差、化学沉淀方法具有成本优势但是容易产生大量的污泥、溶剂萃取方法毒性大且易造成二次污染。与常规物理化学修复方法相比，使用生物修复方法显得更高效、廉价、环境友好，且在低浓度下也能很好工作。为此，各种生物修复技术被相继开发和报道，尤以植物和微生物为多。植物修复能够通过自身的吸收、降解、过滤重金属等作用以达到降低环境中重金属含量的目的。但植物修复重金属污染仍然面临着许多问题与挑战，例如植物的生长周期长，修复过程较为缓慢；植物修复的有效性与生长环境密切相关；植物难以处理与土壤中的有机质紧密结合的重金属。
4.近年来，微生物修复重金属污染受到人们广泛的关注，越来越多的微生物菌株被开发出来用于重金属污染物的处理。微生物修复技术具有成本低廉、效果明显、操作简便、不产生二次污染等多种优势，成为重金属污染修复研究的热点。微生物修复包括三种方式，生物积累、生物转化、生物吸附，其中前两者均依赖于生理代谢过程，需要活的微生物细胞，而生物吸附不依赖于代谢过程，因此，基于微生物的生物吸附方法受到越来越多的关注。但由于多数自然菌株吸附重金属的效率较低，菌株的特性各异，对应用环境的适应性不强，目前尚未报道有特别理想的自然菌株，需要采用基因工程技术改造以获得比较理想的菌株，文献报道可通过微生物细胞表面展示技术实现重金属吸附蛋白/多肽在微生物细胞表面的表达，从而构建高效微生物吸附剂。但是目前所报道的重金属结合蛋白/多肽的广谱性以及高效性仍有待进一步的提高，并且重金属去除的机制也较为单一，亟需设计开发广谱、高效的重金属吸附工程菌。
5.微生物诱导碳酸盐沉淀(microbially induced carbonate precipitation,micp)是近年来受到广泛关注的一种处理重金属污染废水的方法，自然环境中，受重金属污染土壤中的天然微生物群落可通过将重金属离子转化为矿质晶体沉淀来修复重金属污染，有运用到废水净化或土壤重金属污染治理的巨大潜力。碳酸酐酶(carbonic anhydrases，ca)广泛存在于碳酸盐矿化微生物中，是微生物诱导碳酸盐沉淀中的一种关键酶，能高效催
化二氧化碳、水与碳酸、h
+
之间可逆反应，且具有较高活性和稳定性，因此可通过在微生物中过表达碳酸酐酶以提高生物矿化能力。
6.因此，本发明通过表面展示技术将重金属结合蛋白/多肽表达在具广泛环境适应性的底盘细胞表面，同时耦合由底盘微生物诱导的重金属矿化过程，使其吸附富集的重金属离子矿化成难溶的矿质晶体，脱离环境生态系统的物质循环，以彻底解决重金属污染，建立科学、高效、可行的重金属污染修复方法，对实现重金属污染的持久性污染治理具有重要的意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种广谱、高效吸附并偶联生物矿化去除重金属离子的工程菌，工程菌含有吸附系统和矿化系统；吸附系统含有第一锚定蛋白和重金属吸附蛋白，或者含有第一锚定蛋白和重金属吸附多肽；矿化系统含有第二锚定蛋白和碳酸酐酶。首先，金属结合蛋白/多肽可在转录、翻译后作为锚定蛋白的融合体，展示在细胞表面，进行重金属离子的吸附；然后，碳酸酐酶也可在转录、翻译后作为锚定蛋白的融合体，展示在细胞表面，通过催化co2的水合得到hco
3-，hco
3-在碱性条件下进一步生成co
32-，诱导重金属离子的矿化。由此解决现有技术中重金属结合蛋白/多肽的广谱性不强，高效性不强的技术问题，且无法同时进行重金属离子的矿化的技术问题。
8.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种高效吸附和生物矿化重金属离子的基因工程菌，所述工程菌含有吸附系统和矿化系统；所述吸附系统含有第一锚定蛋白和重金属吸附蛋白，或者含有由第一锚定蛋白和重金属吸附多肽；所述矿化系统含有第二锚定蛋白和碳酸酐酶。
9.优选地，所述重金属吸附蛋白为植物螯合素或金属硫蛋白；所述重金属吸附多肽为六聚组氨酸或cp2多肽。
10.优选地，所述第一锚定蛋白和第二锚定蛋白各自独立地选自锚定蛋白pir1、锚定蛋白cwp110、锚定蛋白cwp3或锚定蛋白cwp6。
11.根据本发明另一方面，提供了一种高效吸附和生物矿化重金属离子的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
12.(1)从解脂耶氏酵母的基因组中扩增出第一锚定蛋白基因，扩增得到重金属结合蛋白或多肽基因片段；通过无缝克隆的方式将第一锚定蛋白基因片段以及重金属结合蛋白或多肽基因片段与载体相连，得到第一重组质粒；
13.(2)将步骤(1)得到的第一重组质粒整合进解脂耶氏酵母基因组，并回收标记；即将所述第一重组质粒在整合同源臂片段处线性化回收，然后转化进入解脂耶氏酵母菌株感受态细胞，再通过诱导实现细菌dna和筛选标记在酵母基因组中的去除从而实现标记回收，得到第一重组菌株；
14.(3)扩增碳酸酐酶目的基因和来源于解脂耶氏酵母的第二锚定蛋白基因，再通过重叠延伸pcr的方法扩增出两者的融合片段，然后将alpha信号肽与该融合片段相连，再与步骤(1)所述的载体连接，得到第二重组质粒；
15.(4)将步骤(3)得到的第二重组质粒整合入步骤(2)所述的第一重组菌株中，并回收标记；即将所述第二重组质粒在整合同源臂片段处线性化回收，然后转化进入解脂耶氏
酵母菌株感受态细胞，再通过诱导实现细菌dna和筛选标记在酵母基因组中的去除从而实现标记回收，得到第二重组菌株，即为所述基因工程菌。
16.根据本发明另一方面，提供了任一项所述的高效吸附和生物矿化重金属离子的基因工程菌在重金属污染修复中的应用。
17.优选地，包括以下步骤：
18.(1)将所述基因工程菌培养后加入含有重金属离子的溶液中，所述基因工程菌表达的重金属结合蛋白或多肽与第一锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在细胞外膜上，所述重金属结合蛋白或多肽与溶液中的重金属离子结合，实现重金属离子的吸附；
19.(2)加入含有co2的碱性缓冲液，所述基因工程菌表达的碳酸酐酶与第二锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在细胞表面，所述碳酸酐酶通过催化co2水合得到hco
3-，hco
3-在碱性条件下进一步生成co
32-，从而诱导重金属离子的矿化，即完成重金属离子的吸附和矿化。
20.优选地，所述重金属离子为pb
2+
、hg
2+
、ni
2+
、cd
2+
和co
2+
中的至少一种。
21.优选地，步骤(2)之后，收集重金属盐沉淀。
22.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
23.(1)本发明中构建的基因工程菌表达的金属结合蛋白/多肽可在转录、翻译后作为锚定蛋白的融合体，展示在细胞表面，进行重金属离子的吸附；然后，碳酸酐酶也可在转录、翻译后作为锚定蛋白的融合体，展示在细胞表面，通过催化co2的水合得到hco
3-，hco
3-在碱性条件下进一步生成co
32-，诱导重金属离子的矿化。
24.(2)本发明构建了一种重金属污染修复的工程菌，该工程菌能通过表面展示重金属结合蛋白/多肽实现pb,hg,ni,cd,co等诸多重金属离子的吸附。
25.(3)本发明构建了一种重金属污染修复的工程菌，该工程菌能通过表面展示碳酸酐酶实现co2的水合，得到hco
3-，hco
3-在碱性条件下进一步生成co
32-，诱导重金属离子的矿化。
26.(4)本发明构建了一种重金属污染修复的工程菌，该工程菌能集吸附和生物矿化重金属元素于一体，为重金属污染修复提供了新思路。
附图说明
27.图1为吸附系统中ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒的示意图；
28.图2为矿化系统中ppuaxp7166-mca-cwp110质粒的示意图；
29.图3为重组菌株po1h-pech/cac对不同重金属离子的吸附结果示意图；
30.图4为碳酸镍、碳酸铅、碳酸镉的扫描电镜图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
32.本发明一种高效吸附和生物矿化重金属离子的基因工程菌的构建及应用，所述集
吸附和矿化于一体的工程菌含有由锚定蛋白、重金属吸附蛋白(如植物螯合素和六聚组氨酸的融合蛋白)组成的吸附系统和由锚定蛋白和碳酸酐酶组成的矿化系统。
33.一些实施例中，所述吸附系统通过在解脂耶氏酵母po1h菌株中转入ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒构建而成，该质粒包括解脂耶氏酵母pir类型的锚定蛋白pir1以及一个金属结合蛋白植物螯合素ecs和一个金属结合肽六聚组氨酸多肽。所述矿化系统通过在含有吸附系统的重组菌株中进一步转入ppuaxp7166-mca-cwp110质粒构建而成，该质粒包括一个alpha信号肽，一个gpi类型的锚定蛋白cwp110和一个碳酸酐酶基因mca。
34.一些实施例中，本发明所述含有吸附系统的工程菌的构建包括以下步骤：
35.1)ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒的构建：提取解脂耶氏酵母po1h的基因组，以该基因组为模板，设计引物pcr扩增出锚定蛋白pir1，连接t载体转化大肠杆菌，通过测序确认pir1的基因序列，再通过对质粒酶切得到带有连接肽的植物螯合素ecs和六聚组氨酸多肽his的融合片段(g4s)3linker-ecs-his，最后通过无缝克隆的方式将pir1基因片段、(g4s)3linker-ecs-his融合片段与载体ppuaxp7166相连，得到重组质粒ppuaxp7166-pir1-ecs-his；
36.2)ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒整合进解脂耶氏酵母基因组以及标记的回收：将1)所述质粒在整合同源臂片段处线性化回收，通过醋酸锂转化进入解脂耶氏酵母菌株po1h感受态细胞，在md培养基中筛选，再进一步通过油酸诱导实现细菌dna、筛选标记和cre基因表达盒在酵母基因组中的去除从而实现标记回收，得到的克隆子进一步经过基因组pcr验证确认是否转化成功，验证成功的重组菌株命名为po1h-pech；
37.3)ppuaxp7166-mca-cwp110质粒的构建：分别用引物扩增出来源于methanosarcina mazei的碳酸酐酶目的基因mca基因和来源于解脂耶氏酵母的锚定蛋白基因cwp110基因，再通过重叠延伸pcr的方法扩增出两者的融合片段，然后通过pcr将来源于xpr2基因启动子的alpha信号肽与融合片段相连，最后通过酶切和酶连的方式与载体ppuaxp7166相连，得到重组质粒ppuaxp7166-mca-cwp110；
38.4)ppuaxp7166-mca-cwp110质粒整合入步骤(2)所述含有ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒的解脂耶氏酵母基因组以及标记的回收：所述质粒在整合同源臂片段处线性化回收，通过醋酸锂转化进入解脂耶氏酵母菌株po1h-pech感受态细胞，在md培养基中筛选，再进一步通过油酸诱导油酸诱导从而实现细菌dna、筛选标记和cre基因表达盒在酵母基因组中的去除实现标记回收，得到的克隆子进一步经过基因组pcr验证确认是否转化成功，验证成功的重组菌株命名为po1h-pech/cac。
39.一些实施例中，本发明所述含有吸附系统的工程菌的构建步骤如下：
40.1)提取解脂耶氏酵母po1h基因组，以基因组为模板，pcr扩增得到pir1基因片段，将该片段连接到t载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布平板，挑取克隆子进行菌落pcr，并且通过测序验证pir1的序列；
41.2)以公司合成的puc57-ecs-his质粒为模板，设计引物扩增得到(g4s)3linker-ecs-his融合片段，再通过无缝克隆将(g4s)3linker-ecs-his融合片段，pir1基因片段与经noti/clai双酶切纯化后的载体ppuaxp7166连接得到ppuaxp7166-pir1-ecs-his载体(如附图1所示)。
42.3)ppuaxp7166-pir1-ecs-his载体经过nsii酶切线性化回收后通过醋酸锂转化法
进解脂耶氏酵母po1h感受态细胞中，利用md培养基进行筛选，通过油酸的诱导实现实现细菌dna、筛选标记和cre基因表达盒在酵母基因组中的去除，从而实现筛选标记的重复利用再进一步通过基因组pcr验证，获得阳性克隆子，命名为po1h-pech；
43.4)以实验室保存的含mca基因的载体和商业化pina1317-cwp110载体为模板，设计引物pcr分别得到mca片段和cwp110片段，经过重叠延伸pcr技术融合连接两个片段得到含有(g4s)3连接肽的mca-cwp110的融合片段，然后再设计引物pcr得到alpha信号肽与mca-cwp110相连，在其两端引入noti和clai酶切位点，与载体ppuaxp7166经noti/clai双酶切纯化后连接得到ppuaxp7166-mca-cwp110载体；
44.5)ppuaxp7166-mca-cwp110载体经过nsii酶切线性化回收后通过醋酸锂转化法转化进含有ppuaxp7166-pir1-ecs-his质粒的感受态细胞po1h-pech中，利用md培养基进行筛选，通过油酸的诱导实现细菌dna、筛选标记和cre基因表达盒在酵母基因组中的去除，从而实现筛选标记的重复利用，再进一步通过基因组pcr验证，获得含有两个质粒的阳性克隆子po1h-pech/cac。
45.本发明所述的构建方法所得到的集重金属离子吸附与生物矿化于一体的表面展示工程菌在重金属污染修复中的应用。
46.一些实施例中，所述应用具体包括以下步骤：
47.1)将重组菌株po1h-pech/cac和对照菌株polh转入bmsy培养基中扩大培养至生长对数期后期，收集发酵液并离心，弃去上清，保留沉淀；
48.2)沉淀随后用hepes缓冲液(50mm，ph 6.5)洗涤沉淀两次，最后用50ml hepes缓冲液(50mm，ph 6.5)重新悬浮。
49.3)取od600为1.0的细胞，加入到含有500um浓度的不同重金属的hepes缓冲液中，28℃，100rpm孵育2h。
50.4)利用icp-oes测定反应体系中吸附前和吸附后的重金属浓度。
51.5)收集吸附了重金属离子的菌株，并与5ml的tris-hcl缓冲液(20mm，ph 8.3)混合，再加入预先制备好的含有饱和co2的溶液，反应10min，离心收集上清。
52.6)向上清中分别加入不同的重金属离子溶液，反应一段时间后，收集金属盐沉淀。
53.7)金属盐沉淀收集后烘干，用扫描电子显微镜表征沉淀的结构。
54.8)取一部分金属碳酸盐沉淀进行酸处理。
55.本发明菌株和质粒：大肠杆菌top10感受态细胞购于维地生物；po1h菌株为本实验室保存；ppuaxp7166质粒(专利文献：cn 202210528110x)由本实验室自主研发并保存，puc57-ecs-his质粒由武汉擎科生物有限公司合成。
56.本发明酶和试剂盒等：限制性内切酶、pcr所用的酶制剂、连接酶试剂盒solution i等购于takara公司；seamless cloning kit无缝克隆试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和dna回收试剂盒购于omega公司。
57.生长条件：大肠杆菌于37℃生长，解脂耶氏酵母菌于28℃生长。
58.合成引物：
[0059][0060]
以下为具体实施例：
[0061]
实施例1含重金属离子吸附系统工程菌的构建
[0062]
(1)重金属离子吸附质粒的构建
[0063]
a、以解脂耶氏酵母po1h基因组为模板，使用引物pir1-f和pir1-r通过基因组pcr扩增得到pir1基因片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；
[0064]
b、纯化后的片段连接t载体，末端加a后与pmd19-t载体通过takara公司的连接试剂盒solution i在16℃下连接1h后转化大肠杆菌top10感受态细胞，克隆子经含有100μg/ml ampicilin的lb平板筛选，随机挑选长出的克隆子抽质粒测序验证确定pir1的序列；
[0065]
c、以公司构建的puc57-ecs-his质粒为模板，使用引物ecs-f和ecs-r通过pcr扩增得到(g4s)3linker-ecs-his融合片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；
[0066]
d、ppuaxp7166载体经过not i和cla i酶切后回收，回收后的载体和pir1基因片段，(g4s)3linker-ecs-his融合片段通过碧云天生物技术有限公司的seamless cloning kit无缝克隆试剂盒在50℃下连接30min后转化大肠杆菌top10感受态细胞，克隆子经含有100μg/ml ampicilin的lb平板筛选，随机挑选长出的克隆子抽质粒酶切验证后，经测序验证正确后命名为ppuaxp7166-pir1-ecs-his(如附图1所示)。
[0067]
(2)含重金属离子吸附系统工程菌的构建
[0068]
质粒ppuaxp7166-pir1-ecs-his经过nsi i单酶切线性化后通过醋酸锂转化入解脂耶氏酵母po1h感受态细胞，重组子经md培养基筛选，并且利用油酸诱导进行ura筛选标记的回收，生长出的克隆子随机挑选3个抽取基因组，通过7166-f和7166-r引物对进行基因组pcr验证，结果符合预期的阳性克隆子命名为po1h-pech；
[0069]
实施例2集重金属离子吸附和生物矿化于一体的工程菌的构建
[0070]
(1)含重金属离子生物矿化质粒的构建
[0071]
a、以实验室保存的含mca基因的载体为模板，使用引物mca-f和mca-r通过pcr扩增得到mca基因片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；
[0072]
b、以本实验室保存的pina1317-cwp110载体(岳礼溪.解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及应用的初步研究[d].山东:中国海洋大学,2009.)为模板，使用引物cwp-f和cwp-r通过pcr扩增cwp110基因片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；
[0073]
c、以纯化回收的mca基因片段和cwp110基因片段为模板，使用引物mca-f和cwp-r进行重叠延伸pcr扩增得到mca-cwp110的融合片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，回收后的片段再使用引物alpha-f和cwp-r进行pcr扩增得到含有alpha信号肽的mca-cwp110的融合片段，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化；
[0074]
d、含有alpha信号肽的mca-cwp110融合片段以not i和cla i双酶切后纯化回收，然后与ppuaxp7166载体经过not i和cla i酶切后胶回收的载体以6.5：1混合，通过takara公司的连接试剂盒solution i在16℃下连接1h后转化大肠杆菌top10感受态细胞，克隆子经含有100μg/ml ampicilin的lb平板筛选，随机挑选长出的克隆子抽质粒酶切验证后，经测序验证正确后命名为ppuaxp7166-mca-cwp110(如附图2所示)。
[0075]
(2)集重金属离子吸附和生物矿化于一体的工程菌的构建
[0076]
矿化系统中的质粒ppuaxp7166-mca-cwp110经过nsi i单酶切线性化后通过醋酸锂转化入解脂耶氏酵母po1h-pech感受态细胞，重组子经md培养基筛选，并且利用油酸诱导进行ura筛选标记的回收，生长出的克隆子随机挑选3个抽取基因组，通过7166-f和7166-r引物对进行基因组pcr验证，结果符合预期的阳性克隆子，命名为po1h-pech/cac。
[0077]
实施例3集重金属离子吸附和生物矿化于一体的工程菌的应用
[0078]
工程菌的应用步骤如下：
[0079]
a、解脂耶氏酵母po1h-pech/cac在bmsy培养基中培养至生长对数期后期，5000rpm离心收集菌体，用hepes缓冲液(50mm，ph 6.5)洗涤沉淀两次，最后用50ml hepes缓冲液(50mm，ph 6.5)重新悬浮。
[0080]
b、取od600为1.0的细胞，分别加入到含有500um浓度的pb
2+
、hg
2+
、ni
2+
、cd
2+
、co
2+
的hepes缓冲液中，28℃，100rpm孵育2h。
[0081]
c、离心收集菌体，并用hepes缓冲液洗涤，利用icp-oes测定上清吸附前和吸附后的重金属浓度。结果(如附图3所示)所示，表面展示工程菌对pb
2+
、hg
2+
、ni
2+
、cd
2+
、co
2+
的吸附量都优于对照菌株。并且工程菌对pb
2+
的去除率可达到75.39％，对ni
2+
的吸附量是对照组的5.8倍，对hg
2+
、cd
2+
、co
2+
的吸附量是对照组的两倍。
[0082]
d、收集吸附了重金属离子的菌体，并与5ml tris-hcl缓冲液(20mm,ph 8.3)混合，再加入预先制备好的含有饱和co2的溶液，反应10min，离心去除菌体收集上清。
[0083]
e、向上清中分别加入含有30mm cd
2+
、3mm pb
2+
、30mm ni
2+
的tris-hcl缓冲液中，反应十分钟。
[0084]
f、矿化后的沉淀通过离心收集，60℃烘干，用扫描电子显微镜表征金属碳酸盐沉淀的结构，电镜结果(如附图4)显示不同金属离子的碳酸盐晶体存在差异，其中，图4中的a是碳酸镍、图4中的b是碳酸铅、图4中的c是碳酸镉。
[0085]
g、取一部分金属碳酸盐与沉淀混合进行酸处理，各加入100ul的稀硝酸，观察到均有气泡产生，说明产生了重金属盐沉淀。
[0086]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。