一种提高伊短菌素合成的短短芽孢杆菌工程菌株及其构建方法与应用与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及提高伊短菌素合成的短短芽孢杆菌工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、短短芽孢杆菌（ brevibacillus brevis）是一类革兰氏阳性菌，呈杆状，产芽孢，不产生毒素，能生成多种抗菌活性物质，被广泛应用于植物病害的生物防治。伊短菌素（edeines）是短短芽孢杆菌产生的一种非核糖体肽类抗生素，由四种非常规氨基酸残基、甘氨酸和一个聚胺组成。edeines不通过核糖体合成，而是由“硫模板多聚酶机制”的多功能酶复合系统合成的一类肽类化合物。edeines独特的分子结构形式赋予其多种生物抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、支原体和肿瘤细胞都有很好的抑制作用。edeines属于广谱抗菌素，具有浓度依赖性，低浓度时(<15μg/ml)可逆性地抑制dna聚合酶 ii和iii的活性进而抑制dna 合成，但是不影响蛋白质的合成，表现为抑菌活性（kurylo-borowskaz, szer w. biochimbiophys acta. inhibition of bacterial dna synthesis byedeine. effect on escherichia coli mutants lacking dna polymerase i. 1972,287(2): 236-245.）；在高浓度(>150 μg /ml)时，edeines结合到核糖体小亚基（30s 亚基）的p位点，竞争性抑制fmet-trna 在核糖体上的结合，抑制蛋白质转录翻译的起始，进而抑制蛋白合成，表现为杀菌活性（dinos g, wilson dn, teraoka y, et al. dissectingthe ribosomal inhibition mechanisms of edeine and pactamycin: the universallyconserved residues g693 and c795 regulate p-site rna binding [j]. mol cell.,2004, 13(1):113-124.）。此外，edeines可以作为转录抑制剂用于研究核糖体功能和蛋白合成，还具有消除质粒编码的细菌抗药性和抑制枯草芽孢杆菌细胞分裂的作用（semenchenko a, oliveira g, atman ap. hybrid agent-based model forquantitative in-silico cell-free protein synthesis [j]. biosystems., 2016 ,150:22-34.；shimotohno kw, kawamura f, natori y, et al. inhibition ofseptation in bacillus subtilis by a peptide antibiotic, edeine b(1) [j]. biolpharm bull., 2010,33(4):568-571.）。

2、edeines产生菌较低的产量水平是限制其未来开发应用的主要因素。短短芽孢杆菌x23菌株生物活性突出，其产生的edeines抗菌谱广，已作为茄科作物青枯病生防菌大面积农田推广使用（li l. the whole genome sequencing and mechanism of actionstudy of biocontrol bacteria brevibacillus brevis x23[d]. hunan agriculturaluniversity, 2012.）。x23菌株的全基因组测序已于2012年完成，同时克隆鉴定了edeines生物合成基因簇（chen w, wang y, li d, et al. draft genome sequence ofbrevibacillus brevis strain x23, abiocontrol agent against bacterial wilt[j].journal of bacteriology, 2012, 194(23): 6634-6635.；liu q, shen q, bian x, etal. simple and rapid direct cloning and heterologous expression of naturalproduct biosynthetic gene cluster in bacillus subtilis via red/etrecombineering[j]. scientific reports, 2016, 6: 34623.）。

3、尽管随着基因组测序的展开，在许多芽孢杆菌中发现了parb家族同源蛋白，但它们的功能并不清楚。有必要在此基础上，继续研究edeines生物合成过程中调控蛋白的具体功能，揭示调控基因对edeines产量的影响机制。预期对edeines生物合成调控机制的研究，将深化对edeines生物合成的理解，为通过基因功能进行定向遗传改良构建edeines高产菌株提供理论依据。

技术实现思路

1、本发明通过对edeines生物合成基因簇的生物信息学分析，发现了1个可能转录调控基因 edeb。edeb蛋白序列中包含典型的螺旋-转角-螺旋（hth， helix-turn-helix），属于parb蛋白家族。本发明利用red/et同源重组技术，敲除 edeb基因获得缺失突变株x23(δedeb)，利用表达质粒pad-apr-px-edeb载体构建回补菌株x23(δedeb) (pad-apr-px-edeb)和过表达菌株x23 (pad-apr-px-edeb)，通过对 edeb基因缺失突变株、回补菌株、过表达菌株和野生型菌株x23发酵产量的对比分析，考察了 edeb对edeines产量的影响，通过emsa实验确认了edeb蛋白与edeines基因簇启动子的结合能力，为edeines生物合成调控机制研究奠定了基础，并为后续提高edeines产量提供了参考。由此完成了本发明。

2、本发明首先提供一种转录因子 edeb基因，所编码的氨基酸序列如seq id no：2所示，或者来自于短短芽孢杆菌且具有与其至少95%以上，优98%以上，更优选99%以上的同一性，仍具所述功能的基因。

3、进一步提供含有所述的转录因子 edeb基因的表达盒、表达载体、重组细胞。

4、本发明还提供所述的转录因子 edeb基因编码的蛋白。

5、本发明也提供上述基因和蛋白在产伊短菌素中的应用、或在制备生防菌中的应用，例如制备作为茄科作物青枯病、枯萎病和疫病的生防菌中的应用。

6、本发明尤其提供一种遗传改良的伊短菌素高产短短芽孢杆菌，其在出发短短芽孢杆菌中敲除 edeb基因，或降低 edeb基因的表达，或降低所述 edeb基因表达蛋白的活性。

7、优选地，通过基因编辑方法将所述 edeb基因进行敲除获得。

8、具体地，所述 edeb基因的编码的氨基酸序列如seq id no：2所示，或者来自于短短芽孢杆菌且具有与其至少95%以上，优98%以上，更优选99%以上的同一性，仍具所述功能的基因。

9、更优选地，所述 edeb基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

10、本发明还提供所述的伊短菌素高产短短芽孢杆菌在产伊短菌素中的应用。

11、本发明也提供所述的伊短菌素高产短短芽孢杆菌在作为生防菌中的应用。优选地，作为茄科作物青枯病、枯萎病和疫病的生防菌中的应用。

12、本发明通过挖掘发现短短芽孢杆菌的转录因子 edeb基因，其在edeines生物合成过程中起着正调控作用。过表达 edeb基因可显著增加短短芽孢杆菌x23中edeines的产量。与野生型x23相比， edeb基因过表达可使edeines总产量增加92.27 %。可在制备生防菌等中有较大的应用价值。

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