构建高效利用甲酸的重组需钠弧菌的方法

本发明属于代谢工程领域，涉及一种构建可高效利用甲酸作为唯一碳源的重组需钠弧菌的方法、该重组需钠弧菌的用途。

背景技术：

1、甲酸是大宗化工原料，可通过还原二氧化碳直接获得，来源广泛、价格低廉。液态甲酸方便运输、水溶性高，可作为碳源和能量、良好的代糖原料供微生物生长所用。以甲酸为发酵原料的微生物细胞工厂合成高价值产品的策略可有效联接化工生产和生物制造两大技术领域，实现工业微生物发酵原料革新和显著降低生产成本，并建立新的以二氧化碳和可再生能源为基础的可持续生物生产路线。然而，目前的甲酸生物利用效率较低，距离工业化应用尚有较大距离。微生物的甲酸代谢存在多方面的问题，包括代谢能力低、耐受性差、发酵周期长等。因此，开发可耐受甲酸毒性并高效转化甲酸的微生物底盘细胞是实现甲酸生物炼制工业化的重要环节。

2、可以甲酸为唯一碳源的微生物有多种，代表菌株为甲基营养菌。但该类细菌的遗传改造较为困难。在一些易于遗传改造的模式微生物中引入甲酸同化途径并实现甲酸高效利用是目前研究的热点，专利文献cn202210564130.2报道了对大肠杆菌进行基因工程改造后得到高效利用甲酸的工程菌。在模式微生物中异源表达的甲酸同化途径主要有三种：丝氨酸循环、还原性乙酰辅酶a途径和还原性甘氨酸途径。虽然甲酸同化途径已在大肠杆菌和酿酒酵母中构建成功并被证明可以发挥作用，但依然存在能量需求大、菌株生长差、甲酸利用率低等不足，难以在工业上应用。因此，利用全新思路克服上述缺陷是今后需要重点关注的研究方向，同时也是一项具有挑战性的工作。

3、需钠弧菌(vibrio natriegens)是目前报道的生长最快的微生物之一，是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增周期在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌，有潜力作为一种优良底盘细胞受到越来越多的关注，或可发展成为一个特色表达系统。研究发现，需钠弧菌单个细胞核糖体数量高达115000个，而大肠杆菌只有约70000～90000个，这意味着需钠弧菌具有更快的生物量合成速度和更强的蛋白表达能力。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达目标产物比如外源蛋白、特定代谢物时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本，具有经济意义。

4、相较于其他微生物，需钠弧菌在甲酸利用方面具有潜在的优势：(1)具有完整的还原性甘氨酸途径、丝氨酸循环途径等，暗示该菌具有甲酸利用能力，有可能是构建甲酸生物转化平台的理想宿主微生物；(2)生长迅速、发酵周期短，工业应用潜力高；(3)具有成熟的遗传操作方(stukenberg d.,et al.the marburg collection:a golden gate dnaassembly framework for synthetic biology applications in vibrio natriegens[j].acs synth biol.2021,10(8):1904-1919.tschirhart t.,et al.synthetic biologytools for the fast-growing marine bacterium vibrio natriegens[j].acs synthbiol.2019,8(9):2069-2079.)。近年来，发明人在需钠弧菌中逐渐建立了一系列分子遗传操作技术，实现了高效的基因组编辑，为后续优化该菌的甲酸代谢途径以及目标产物的合成提供了技术保证。

技术实现思路

1、发明人在2020年测试了需钠弧菌野生型菌株(vibrio natriegens atcc14048)对甲酸的耐受和利用情况，发现该菌能够耐受较高的甲酸浓度，且能消耗较多的甲酸，是构建甲酸细胞工厂的良好出发菌株。于是，发明人着手开始对需钠弧菌的代谢路径进行改造设计和实验测试，即敲除其丝氨酸循环和三羧酸循环中催化苹果酸和草酰乙酸转换的关键酶，使这两个循环融合成为一个大循环，从而通过与之偶联的四氢叶酸循环拉动上游的甲酸同化代谢，提高需钠弧菌的甲酸同化能力。同时，敲除丝氨酸合成代谢通路的关键基因，构建丝氨酸合成缺陷型菌株，使丝氨酸的合成能且仅能通过四氢叶酸循环进行，以进一步提高上游的甲酸同化代谢能力。在此基础上，发明人进一步通过实验室适应性进化来优化工程菌株的甲酸耐受和利用能力，直至实现其能够利用甲酸为唯一碳源进行生长。上述改造策略包括对malate synthase(pn96_10585)、malate dehydrogenase(pn96_11695,pn96_07295,pn96_14755)、malate:quinone oxidoreductase(pn96_19465,pn96_06470)，d-3-phosphoglycerate dehydrogenase(pn96_00930)的编码基因进行了组合敲除，构建了融合丝氨酸循环和三羧酸循环的需钠弧菌突变株(命名为s-tca系列)，并表征了这些突变株的性状。研究结果表明，突变株的甲酸利用能力相对于原始菌株有显著提升。因此，本发明包括如下技术方案：

2、一种构建可利用甲酸作为唯一碳源的重组需钠弧菌的方法，包括下述步骤：

3、a.将需钠弧菌野生型菌株的丝氨酸循环(serine cycle)和三羧酸循环途径(tcacycle)融合形成一个大循环(简称s-tca循环)，从而通过与之偶联的四氢叶酸循环拉动甲酸的同化代谢，提高需钠弧菌的甲酸同化能力，得到菌株a；并且/或者，

4、b.敲除菌株a中丝氨酸合成代谢通路中的相关初级代谢途径的基因，构建丝氨酸合成的缺陷型菌株，使其丝氨酸合成仅能通过四氢叶酸循环完成，从而同步提高四氢叶酸循环同化甲酸的能力，得到甲酸利用能力提高的重组需钠弧菌菌株b(命名为s-tca)。

5、优选地，上述需钠弧菌野生型菌株可以是vibrio natriegens atcc14048。

6、上述步骤a例如包括：组合中断或下调表达下述基因中的一个以上、两个以上或者三个：苹果酸合成酶(malate synthase)编码基因pn96_10585、苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)编码基因pn96_07295和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)编码基因pn96_14755(本文中称为pathway 2，途径2)；组合中断或下调表达下述基因中的一个以上、两个以上或者三个：苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)编码基因pn96_11695、苹果酸醌氧化还原酶(malate quinone oxidoreductase)编码基因pn96_19465和苹果酸醌氧化还原酶(malate quinone oxidoreductase)编码基因pn96_06470，步骤a在本文中被称为pathway 3(途径3)。

7、上述步骤b例如包括：中断(disruption)或下调表达需钠弧菌基因组中的d-3-磷酸甘油酸脱氢酶(d-3-phosphoglycerate dehydrogenase)编码基因pn96_00930(本文中称为pathway 1，途径1)。

8、进一步地，上述方法还包括下述步骤：

9、c.对菌株b进行适应性进化，提高其甲酸耐受和利用能力，得到可利用甲酸为唯一碳源进行生长的进化菌株(本文中命名为s-tca2.1)。

10、上述适应性进化可以包括下述步骤：

11、c-1.使菌株b在甲酸盐环境胁迫压力下进行连续传代的驯化，得到耐受不低于30g/l二水甲酸钠的培养基、甲酸盐代谢能力增强的进化菌株c-1，和/或，

12、c-2.对进化菌株c-1进行诱变和传代，得到能在包含不低于100g/l二水甲酸钠的培养基中生长、甲酸代谢增强的诱变菌株c-2(本文中命名为s-tca1.0)，和/或，

13、c-3.继续对诱变菌株c-2进行诱变和传代，得到能耐受不低于40g/l二水甲酸钠环境浓度、并能在以甲酸为唯一碳源的培养基中生长的进化菌株c-3(本文中命名为s-tca2.1)。

14、上述步骤a和步骤b中基因的中断可以是该基因的丧失或者功能大幅度下调，包括该基因的敲除、缺失、失活，一般可以通过敲除、插入失活、移码突变、引入终止密码子提前翻译终止等常规的基因操作手段实现。所述基因失活可选自下组方式：核苷酸序列全部删除，核苷酸序列部分删除，基因突变，阅读框内突变终止密码子。

15、步骤a和步骤b中基因的下调表达选自下组方式：蛋白泛素化修饰，rna干涉(rnai)，表达系统发生结构改变，转录水平发生负性调控，转录后水平发生负性调控，基因的转录降低，基因的翻译降低，蛋白质降解的增强，它们中两种以上的组合。

16、步骤a和步骤b中基因的中断和下调表达通过基因编辑技术实施，所述通过基因编辑技术选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent(multiplex genome editing by naturaltransformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)，crispri。

17、本发明的第二个方面提供了一种可利用甲酸作为碳源代替糖类原料的重组需钠弧菌，其按照上述的方法构建得到。

18、优选地，所述重组需钠弧菌是保藏编号为cctcc no:m 20221372的需钠弧菌(vibrio natriegens)，保藏于中国典型培养物保藏中心，本文中命名为s-tca2.1。

19、本发明的第三个方面提供了上述重组需钠弧菌作为基因工程宿主菌的用途。本领域技术人员容易理解，该重组需钠弧菌可以作为平台用于表达外源基因、重组蛋白或者代谢产物。

20、通过上述代谢工程改造，本发明构建、驯化和筛选得到的重组需钠弧菌s-tca2.1能够在包含40g/l二水甲酸钠的培养基中生长，并高效地消耗甲酸；并且能在包含40g/l二水甲酸钠作为唯一碳源的m9培养基中生长的情况下24小时内能够消耗约30g/l的二水甲酸钠，开发应用潜力巨大。

21、本发明经代谢工程改造和诱变筛选出的可利用甲酸作为唯一碳源的菌株s-tca2.1的拉丁学名是vibrio natriegens，中文名称是需钠弧菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2022年09月05日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221372。