血液胞外囊泡miRNA在区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是区分卵巢良性病变和恶性肿瘤的血液胞外囊泡mir-335-5p及其应用。

背景技术：

1、卵巢癌是起源于卵巢的恶性妇科肿瘤，也是病死率最高的恶性妇科肿瘤。卵巢癌主要分为上皮性卵巢癌、生殖细胞肿瘤和性索间质肿瘤三大类，其中上皮性卵巢癌占绝大部分。上皮性卵巢癌中最常见的是高级别浆液性癌，其次是子宫内膜样癌、透明细胞癌等。卵巢癌组织类型复杂，卵巢癌早期患者症状模糊，大约75％的卵巢癌患者最初诊时仅被认为是患有腹内疾病，超过70％的卵巢癌患者在确诊时已处于晚期并扩散到骨盆之外，常伴随弥漫性恶性腹水和腹膜内转移，预后很差，5年生存率低于20％。卵巢癌患者的预后情况与初始诊断时的疾病阶段直接相关，初诊为i期的卵巢癌患者在干预治疗后5年生存率达到约90％，所以早期发现是治愈卵巢癌的关键。因此，卵巢癌精准且高效的早期诊断对卵巢癌患者具有重要的临床意义。

2、目前，临床上卵巢癌的诊断方法包括腹部影像学和血清学肿瘤标志物检测，但这些方法对于卵巢癌的早期诊断效果均有一定的局限性。腹部影像学主要包括阴道超声检查(tvs)、计算机扫描断层(ct)、核磁共振成像(mri)和pet/ct等。卵巢癌早期阶段肿瘤体积较小且不引起卵巢形态结构变化，超声检查可能导致假阴性的结果，此外大约18％-30％的其他病变信息不能由超声确定。对于直径大于1cm的肿瘤，ct检测的灵敏度可达85％-95％，特异性91-96％，但对于直径小于1cm或更小体积肿瘤，ct检测的敏感度降至25％-50％。mri作为超声检查的补充工具，虽然在检测软组织时分辨率比ct更有优势，但是检测直径小于5mm的肿瘤时仍然效果不佳。pet/ct价格高昂，且在诊断卵巢癌某些区域转移时灵敏度欠佳，比如在小肠系膜转移和右上腹转移的检测灵敏度仅为64％和65％。血清学肿瘤标志物检测主要包括ca125与he4。ca125尽管被用作卵巢癌的肿瘤标志物，但约有一半的卵巢癌患者早期并不出现ca125升高，而部分卵巢良性病变患者却伴随ca125的升高，因此ca125用于卵巢癌诊断的效果有限，敏感性和准确率仅分别为59.02％和70.35％。he4诊断卵巢癌的敏感性和额特异性分别为63.11％和72.67％。上述方法均不能在卵巢癌中进行精准的早期诊断。

3、因此，开发能高效且准确的卵巢癌早期鉴别诊断肿瘤标志物对改善卵巢癌患者预后情况至关重要。

技术实现思路

1、本发明旨在确定并验证卵巢癌患者来源的血液胞外囊泡mirna作为卵巢癌早期诊断的生物标志物，作为传统影像学检测技术的补充，提高卵巢癌患者早期诊断的敏感性、特异性和准确性，减少早期卵巢癌患者的漏诊和误诊，从而给予患者更合适的治疗方案，改善患者预后。

2、为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上早期诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢良性病变和恶性肿瘤。

3、本发明还提供了能够在临床上早期诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤的芯片和试剂盒。

4、本发明还提供了利用所述生物标志物早期诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤的方法。

5、在第一方面，本发明提供血液胞外囊泡mirna在制备用于卵巢癌的早期诊断的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。

6、在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡mirna是：

7、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

8、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

9、在具体的实施方式中，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤。

10、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

11、在第二方面，本发明提供一种mirna芯片，所述的mirna芯片包括：

12、固相载体；以及

13、有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合mirna；

14、其中，所述的mirna是：

15、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

16、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

17、在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：

18、互补结合区；和/或

19、与固相载体相连的连接区。

20、在具体的实施方式中，所述mirna芯片用于卵巢癌的早期诊断，尤其是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤。

21、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

22、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

23、在第三方面，本发明提供第二方面所述的mirna芯片的用途，用于制备卵巢癌的早期诊断的检测试剂盒。

24、在具体的实施方式中，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢良性病变和恶性肿瘤。

25、在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测mirna的检测试剂；

26、其中，所述的mirna是：

27、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

28、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna；

29、或者，所述检测试剂盒装有第二方面所述的mirna芯片。

30、在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于卵巢癌的早期诊断，尤其是区分卵巢良性病变和恶性肿瘤。

31、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

32、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

33、在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，用于卵巢癌的早期诊断：

34、其中，所述的mirna是：

35、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

36、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

37、在优选的实施方式中，所述的卵巢癌的早期诊断是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤。

38、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

39、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

40、在第六方面，本发明提供一种卵巢癌的早期诊断的方法，包括步骤：

41、(a)根据训练队列mirna表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；

42、(b)以待测对象mirna表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；

43、所述的mirna是：

44、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

45、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

46、在优选的实施方式中，所述的卵巢癌的早期诊断是区分卵巢良性病变和恶性肿瘤，其中，所述对照样本是卵巢良性病变样本。

47、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

48、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

49、在优选的实施方式中，所述参比值为5.66。

50、在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，所述的mirna是：

51、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

52、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

53、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

54、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

55、在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内剪切并表达成所述的mirna。

56、在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内被剪切且表达成所述的mirna。

57、在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式i所示的结构：

58、seq正向-x-seq反向  式i

59、式i中，

60、seq正向为能在人细胞中表达成所述的mirna的核苷酸序列；

61、seq反向为与seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

62、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补；

63、式i所示的结构在转入人细胞后，形成式ii所示的二级结构：

64、

65、式ii中，seq正向、seq反向和x的定义如上述，

66、||表示在seq正向和seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

67、在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的mirna或所述的多核苷酸。

68、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。