小麦内生菌株耐盐芽孢杆菌YB-1576、生防菌剂及其应用

小麦内生菌株耐盐芽孢杆菌yb-1576、生防菌剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种小麦内生菌株耐盐芽孢杆菌yb-1576、生防菌剂及其应用。


背景技术：

2.小麦是全世界人类和牲畜的主要食物来源。而当前小麦产量和质量受到多种真菌病害的影响；其中，由假禾谷镰刀菌等引起的小麦茎基腐病是全世界小麦最具破坏性的病害之一，它不仅导致小麦产量的大幅度减产甚至绝收，而且还会在小麦籽粒中污染多种有害真菌毒素（如脱氧雪腐镰孢菌烯醇等），对食品安全和人畜健康安全构成严重威胁。
3.目前，小麦茎基腐病的防控措施主要有培育抗性品种和施用化学药剂。培育和种植抗病品种是防治小麦茎基腐病最经济安全有效的措施；但由于天然抗病种质资源的稀缺性，加之小麦茎基腐病的抗性遗传较为复杂，导致目前传统育种很难获得茎基腐病抗性品种。因而施用化学药剂仍然是当前防治茎基腐病的主要措施；但长期施用化学药剂会导致假禾谷镰孢菌抗药性增强，增加了防控难度。另外，小麦茎基腐病在我国小麦生产区发生的频率明显增加，呈现蔓延扩大的趋势，严重影响着我国小麦的安全、优质生产的可持续性。
4.近年来，全球范围内对生态环境保护越来越重视，提倡绿色环保可持续农业，农作物病害的生物防治越来越受到人们的关注。生防菌剂可减少和避免化学药剂的带来的负面影响，从而达到防治小麦茎腐病的发生及对生态坏境的破坏，进而保障小麦的安全优质生产。因此， 假禾谷镰孢菌高效拮抗菌株的选育及菌剂制备和应用方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
5.公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

6.发明人从小麦中分离得到一种内生菌株耐盐芽孢杆菌（bacillus halotolerans）yb-1576，通过研究发现其代谢产物不仅能够拮抗禾谷镰孢菌（fusarium pseudograminearum， fps）生长，而且可以诱导小麦组织中的防御酶表达，提高小麦对茎基腐病的抗性，进而对小麦茎基腐病具有较好的防治效果。另外，该耐盐芽孢杆菌yb-1576发酵液能促进小麦幼苗的生长发育。
7.根据本技术公开的一个方面，筛选得到一种小麦内生菌yb-1576，其分类命名为bacillus halotolerans，于2022年 4 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101），其保藏编号为 cgmcc no. 24705。
8.根据本技术公开的另一个方面，提供一种含有所述耐盐芽孢杆菌yb-1576或/和其代谢产物的生防菌剂。
9.根据本技术公开的另一个方面，提供一种生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将所述耐盐芽孢杆菌yb-1576接种于lb液体培养基，于28℃，180 rpm条件下，培养其od 600 nm 达至0.8～0.9，所得发酵菌液即为生防菌剂。
10.在本技术公开的一些实施例中，所述lb液体培养基含：胰蛋白胨8～12 g/l，酵母提取物4～6 g/l，氯化钠8～12 g/l，ph 7.0。
11.根据申请本公开的另一个方面，将所述耐盐芽孢杆菌yb-1576或所述生防菌剂应用于小麦茎基腐病防治当中。
12.根据本技术公开的另一个方面，将所述耐盐芽孢杆菌yb-1576或所述生防菌剂应用于促进小麦生长当中。
13.根据本技术公开的另一个方面，将所述耐盐芽孢杆菌yb-1576或所述生防菌剂应用在小麦防御酶活性的提高当中。
14.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：1. 目前尚未有利用耐盐芽孢杆菌防治小麦茎基腐病害的研究报道；耐盐芽孢杆菌菌株之间的表型特性是存在差异的，具有菌株个体特异性；本技术耐盐芽孢杆菌yb-1576是从小麦中分离得到的内生菌，该菌株不仅能够拮抗禾谷镰孢菌生长，而且可以诱导小麦组织中的防御酶表达，提高小麦对茎基腐病的抗性，进而对小麦茎基腐病具有较好的防治效果；另外，耐盐芽孢杆菌yb-1576发酵液能改善小麦的生长发育，起显著促生作用。
15.2. 利用本技术耐盐芽孢杆菌yb-1576制备的生防菌剂能够预防小麦茎基腐病的发生和促进小麦的生长，并减少化学农药的使用，可保障小麦的安全优质生产，具有良好的社会经济效益。
附图说明
16.图1 为本技术一实施例中菌株yb-1576的形态特征与分子鉴定图；其中，(a) na培养基上yb-1576菌落；（b）菌株yb-1576革兰氏染色结果；（c）菌株yb-1576与假禾谷镰孢菌平板对峙结果。
17.图2为本技术一实施例中基于16s rdna基因序列的菌株yb-1576系统进化树图。
具体实施方式
18.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂及原料如无特别说明，均为市售常规市售产品；所涉及的检测、测试、实验方法等，如无特别说明，均为常规方法。
19.为了更好的理解本技术技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
20.实施例一：菌株获取及种类鉴定从小麦上分离得到一株内生菌（2021年5月，谢夏分离于小麦，品种：郑麦366），命名为yb-1576，na培养基菌落为象牙白色，不透明，表面光滑；革兰氏染色阳性，菌体呈杆状（图1a, b），并且对引起小麦茎基腐病的假禾谷镰孢菌具有显著的拮抗作用（图1c）。提取菌株yb-1576基因组dna为模板，用细菌16s rdna序列通用引物27f (5
’‑
agagtttgatcctggctcag
–3’
)和1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)扩增yb-1576菌株16s rrna基因，然后测序获得全长核酸序列，在线与ncbi nr数据库比对分析，结果表明，与
菌株yb-1576 16s rdna序列相似度达到99%以上。
21.采用mega 7.0软件中的muscle软件将yb-1576测序得到的16s rdna序列与从ncbi数据库下载到的已知芽胞杆菌菌株的16s rdna序列进行比对，然后采用nj法构建菌株yb-1576的系统进化树，抽样次数为1000，构建系统进化树（图2），表明yb-1576菌株与已知的bacillus halotolerans的能够聚在同一分支。
22.综上所述，菌株yb-1576鉴定为bacillus halotolerans。
23.实施例二：基于菌株yb-1576的生防菌剂将菌株yb-1576 划线接种于lb固体培养基上活化，然后挑取单菌落接种于lb液体培养基（配方：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，初始ph值调整为7.0），于28℃、180 rpm下培养至od 600 nm为0.8~0.9时的发酵液即为菌株yb-1576生防菌剂。
24.实例三：yb-1576生防菌剂对小麦幼苗的促生验证实验挑选饱满均匀一致的小麦种子，用无菌水冲洗，先用75%乙醇消毒30s，再用无菌蒸馏水冲洗3遍，放置于铺有无菌水润湿滤纸片的培养皿中，25℃保湿培养至小麦露白，然后分别用 107、108和10
9 cfu/ml yb-1576生防菌剂浸种2 h，以无菌蒸馏水浸种作为对照。每个处理重复3次。将浸种后的小麦种子均匀摆放在直径为9 cm铺有菌水润湿的滤纸片 的培养皿中，每皿20粒种子。放置于25 ℃，12 h/12 h光暗交替条件下保湿培养10 d后，取样测定小麦幼苗的鲜重和植株高度。小麦幼苗的促生指标统计方法如下：将皿中的幼苗从滤纸上分离下来，无菌水冲洗干净并吸干水分，进行测量称重；结果表明，107和108cfu/ml yb-1576生防菌剂能够显著促进小麦幼苗的生长，健壮苗株。
25.表1
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yb-1576生防菌剂对小麦幼苗促生指标统计分析。
26.实施例四：菌株yb-1576生防菌剂对小麦茎基腐病防治验证试验将煮熟的小麦籽粒和沙子按照体积比3：1进行混合于500ml 烧瓶中摇匀灭菌，即得麦粒砂培养基。将假禾谷镰孢菌在pda培养基上进行活化，然后用1ml灭菌蓝色枪头挑取5个假禾谷镰孢菌菌丝块放置于灭菌的麦粒砂培养基中，28 ℃培养7 天。将培养好的含有假禾谷镰孢菌的麦粒砂培养基与灭菌的细土按照质量比5%混匀装入10cm
×
10cm的盆中，对照组为灭菌的土壤。挑选饱满均匀一致的小麦种子，用无菌水冲洗，先用75%乙醇消毒30s，再用无菌蒸馏水冲洗3遍，放置于铺有无菌水润湿滤纸片的培养皿中，25℃保湿培养至小麦露白。将培养好的yb-1576生防菌剂调整到浓度为10
8 cfu/ml然后浸种小麦种子，对照组用lb培养基浸种。
27.实验处理设置如下：（1）yb-1576生防菌剂浸种的小麦种子种植在未含有假禾谷镰孢菌的无菌土中；（2）未浸种的小麦种子种植在未含有假禾谷镰孢菌的无菌土中；（3）yb-1576生防菌剂浸种的小麦种子种植在含有假禾谷镰孢菌的无菌土中；（4）未浸种的小麦种子种植在含有假禾谷镰孢菌的无菌土中。
28.各试验处理于25 ℃，12 h/12 h光暗交替条件温室培养20 d后将小麦幼苗用清水冲洗干净，分别统计幼苗地上部分鲜重和长度，地下部分鲜重和长度。
29.调查茎基腐病发病情况，病情分级标准如下：0级为无症状；1级为根/茎发生轻微褐变（小于25%）；2级为中度褐变（25%至50%）；3级为褐变为50%至75%；4级为严重褐变（大于75%），植物组织完全腐烂或死亡。
30.计算病情指数和防治效果，病情指数=∑（病情分级
×
该病级的发病株数）/调查总株数；防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数
×
100%。
31.表2
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yb-1576生防菌剂对小麦幼苗茎基腐病的防治效果。
32.表3
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yb-1576生防菌剂对小麦幼苗生长参数的影响。
33.结果表明，yb-1576生防菌剂能够显著降低小麦幼苗茎腐病的发病率，对照组为 90.31
±
1.43%，yb-1576生防菌剂处理后为14.89
±
2.73%，防治效果为69.73
±
0.86%（表2）；另外，yb-1576生防菌剂能够增加小麦幼苗地上部分鲜重和长度，地下部分鲜重和长度（表3）；yb-1576生防菌剂能够显著促进小麦幼苗的生长及对小麦幼苗茎基腐病具有良好的防治作用。
34.实施例五：yb-1576生防菌剂诱导小麦幼苗防御相关酶表达验证试验在实施例四的基础上，种植后20天，取不同处理的小麦叶片放入液氮中速冻，然后负80
°
c保存。首先，将1g小麦幼苗叶片在预冷研钵中研磨，然后转移到新的1.5 ml 离心管管中，加入1 ml提取缓冲液。在8000
×
g下离心10 min后，将上清液转移到另一个新的1.5 ml离心管中检测酶活性。酶活性的测定采用索莱宝公司的lox (货号：bc0325)，pal(货号：bc0215)，cat (货号： bc0205)，ppo (货号： bc0195) and pod (货号：bc0095)试剂盒进行，结果见表4。结果表明，yb-1576生防菌剂能够提高小麦幼苗中防御酶活性，尤其是在和假禾谷镰孢菌合作中的防御酶活性诱导的更加显著。
35.表4 yb-1576生防菌剂对小麦防御酶活性的影响。
36.尽管已描述了本技术的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包
括优选实施例以及落入本技术范围的所有变更和修改。
37.显然，本领域的技术人员可以对本技术进行各种改动和变型而不脱离本技术之发明精神和范围。这样，倘若这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本技术也意图包含这些改动和变型在内。