一种用于肿瘤侵袭能力检测的支架及其制备方法

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种用于肿瘤侵袭能力检测的支架及其制备方法。


背景技术：

2.大多数癌症死亡是由转移性肿瘤而不是原发肿瘤引起的。癌细胞通过诱导具有发育过程特征的程序的表达，以上皮层或单个细胞的形式侵入正常组织。从它们的起源组织开始，癌细胞会扩散到不同的靶器官，在那里它们会不断增殖进而形成继发性肿瘤（转移）。以往的研究表明，转移不仅需要改变癌细胞，还需要改变肿瘤微环境和转移靶位点。例如，在吸引癌细胞的靶器官中形成了转移前的生态位。该过程所涉及的分子机制尚不完全清楚，但与细胞-细胞和细胞基质粘附，细胞外基质的降解以及新位点早期生长的启动和维持相关的那些机制通常被认为是关键的。因此，了解癌细胞用于形成转移的不同机制将有助于更好地评估患者和设计创新的治疗方法。总的来说，如何直观地观察到癌细胞的侵袭行为是了解肿瘤转移机制的关键。
3.传统的2d细胞培养模型技术较为成熟，因其操作简单、成本低廉和高度可重复性，已经成为了目前体外观察癌细胞侵袭的最常用的方法。但是，传统2d培养模型改变了细胞形态、代谢途径、基因表达和细胞增殖方式，并减少了细胞外基质蛋白的产生，不能很好地体现细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用，无法模拟实体瘤特性和体内癌细胞侵袭的过程。
4.近年来，介于单层的2d细胞培养和动物实验之间的体外3d细胞培养模型技术逐步发展起来，主要是利用悬滴法、液体覆盖法、旋转法等无支架培养方法和支架法等三维培养技术。体外三维培养，克服了上述2d培养的不足，能够更好的模拟体内癌细胞所处的微环境。在细胞功能研究方面，三维培养的优点主要包括：（1）实现细胞间以及细胞外基质的相互作用，能够实现特定的生物信号转导以及细胞增殖、黏附、迁移和蛋白表达等功能。（2）填补了2d细胞培养系统与体内肿瘤之间的鸿沟，不仅可以得到类似于体内实验的生物表型，同时具有体外细胞实验的直观性和条件可控性等优势。（3）便于观测恶性肿瘤在三维环境中的迁移过程。因此，3d培养对肿瘤的生物学行为的研究具有重要意义。
5.尽管可以模拟体内的三维环境，不同的三维培养技术也存在各自的不足。无支架培养方法均需大型的机械装置，价格较为昂贵，并需要特定的培养基以及细胞换液方式，需要实验室具备一定的实验条件。支架法是将具有生物相容性的材料，通过交联、冷冻干燥等方式，使其具有一定支撑力并形成多孔的3d细胞支架。有研究人员采取有机试剂等材料制备复合多孔支架，虽然此方法中材料种类较多，但制备过程复杂且部分材料具有细胞毒性，不利于细胞黏附及生长。因此，制备具有安全无毒、结构稳定、生物相容性好的三维培养的支架是模拟癌细胞侵袭过程的重要基础。此外，以往的研究结果以及相关发明大多数侧重于癌细胞的培养和药物检测。其技术手段在于检测癌细胞在支架上的基因和蛋白的表达，却很少进行对癌细胞生物学行为的检测尤其是癌细胞的侵袭能力的观察。


技术实现要素：

6.本发明的目的是构建能够较好模拟体内肿瘤微环境，安全无毒，并且能够方便直观地观察癌细胞侵袭情况的三维多孔细胞支架，为解决在体外研究中二维培养不能全面模拟癌细胞侵袭的问题、提供三维情况下的肿瘤转移模型、并更好的诠释三维培养中肿瘤细胞侵袭的机制。
7.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种用于肿瘤侵袭能力检测的支架的制备方法，包括以下步骤：s1称取壳聚糖溶于一定浓度乙酸溶液中，搅拌混匀，制成壳聚糖乙酸溶液；s2 配制羧甲基纤维素钠溶液；将羧甲基纤维素钠溶液缓慢滴加至壳聚糖乙酸溶液中，在搅拌机中搅拌获得均匀的壳聚糖-羧甲基纤维素钠混合液；s3 将s2中得到的混合液加入到48孔板中，混合液添加完毕后，将孔板于4
°
c预冷6h，后置于-20
°
c冷冻12h；将冷冻好的样品用冷冻切片机切成圆柱形支架；s4 打开冻干机，预冻4 h后，将s3中切割完毕的支架同样放置于孔板中真空冷冻干燥；s5.配制一定浓度的氨水溶液，将氨水溶液加入装有支架的孔板中，与残留的乙酸结合并反应一小时，期间每隔10min轻轻吹打两下以至于两者充分结合，而后用去离子水漂洗3-4次，除去残余的溶液，后将该孔板置于冰箱-20℃冷冻12-18h；s6 打开冻干机，预冻4 h后，将s5中的支架真空冷冻干燥确保水分全部去除，制得三维多孔细胞支架。
8.进一步的，步骤s1中的乙酸溶液的浓度为4%，壳聚糖乙酸溶液的质量浓度为4%。
9.进一步的，步骤s2中的羧甲基纤维素钠溶液的质量浓度为1%。
10.进一步的，步骤s2中壳聚糖-羧甲基纤维素钠混合液中的聚糖和羧甲基纤维素钠的质量比为8:1，步骤s2羧甲基纤维素钠溶液与壳聚糖乙酸溶液在50℃恒温条件下进行混合。
11.进一步的，步骤s3中将混合液加入到48孔板中时，每孔1ml。
12.进一步的，步骤s3圆柱形支架的厚度为2mm。
13.进一步的，步骤s5氨水溶液的浓度为25%。
14.进一步的，步骤s4、s6中冷冻温度为-75℃～-80℃，冷冻干燥时间分别为24h、48h。
15.另外，本发明还提供上述制备方法制备得到的用于肿瘤侵袭能力检测的支架。
16.本发明还提供上述制备方法制备的用于肿瘤侵袭能力检测的支架在肿瘤侵袭能力检测中的应用。
17.与现有技术相比本发明具有以下有益效果：本发明提供的一种用于肿瘤侵袭能力检测的支架，具有良好的生物相容性，实验证明癌细胞能够在该支架上很好的黏附以及增殖。此外，该支架结构稳定，不易降解能够很好的用来追踪癌细胞在三维环境中的侵袭行为。该支架不仅可以富集肿瘤细胞并模拟体内肿瘤侵袭的微环境，还可以帮助科研人员更加直观地观察癌细胞侵袭的过程以便于开展对肿瘤侵袭能力的检测。
附图说明
18.图1为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架实物图。
19.图2为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架扫描电镜图。
20.图3为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架显微镜图。
21.图4为cck-8法检测普通二维细胞培养、壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架三维培养的细胞增殖能力的变化图。
22.图5为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架上1、3、5天的肝癌细胞活死染色结果图。
23.图6为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架上第七天的细胞骨架染色以及细胞核dapi染色图。
24.图7为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架空白组、壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架上第七天的肝癌细胞黏附的扫描电镜图。
25.图8为实施例1所获得壳聚糖/羧甲基纤维素钠多孔型支架红外图谱。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
27.实施例1一种用于肿瘤侵袭能力检测的支架的制备方法，包括如下步骤：s1:量取4 ml的乙酸溶液于容量瓶中，用去离子水定容至100 ml，配成4 %的乙酸溶液。
28.s2:称取0.8 g壳聚糖溶于20 ml的4%的乙酸溶液中，在搅拌机中搅拌混匀2h，制成20 ml浓度为4%壳聚糖溶液。
29.s3:称取0.1 g羧甲基纤维素钠溶于10 ml的去离子水中，在搅拌机中搅拌1h，制成10 ml的1%羧甲基纤维素钠溶液。
30.s4: s2和s3两种溶液分别在室温下静置过夜，后在50℃恒温条件下，将羧甲基纤维素钠溶液缓慢滴加至壳聚糖溶液中（壳聚糖溶液和羧甲基纤维素钠溶液体积比2:1 混合），在搅拌机中搅拌5 h，以获得均匀的壳聚糖-羧甲基纤维素钠溶液。
31.s5:将s4中得到的混合液加入到48孔板中，每孔1ml。
32.s6:溶液添加完毕后，将孔板于4
°
c预冷6h，后置于-20
°
c冷冻12h。
33.s7:将冷冻好的样品用冷冻切片机切成厚度为2 mm的圆柱形支架。
34.s8:打开冻干机，预冻4 h后，将s7中切割完毕的支架同样放置于孔板中真空冷冻（-75℃～-80℃）干燥24 h。
35.s9:量取25 ml浓度为50%的氨水，加入等量去离子水，稀释成25%的氨水溶液。s10:将s9中得到的氨水溶液加入装有支架的孔板中，与残留的乙酸结合反应一小时，期间每隔10min轻轻吹打两下以至于两者充分结合。而后用去离子水漂洗3-4次，除去残余的溶液。后将该孔板置于冰箱-20℃冷冻12-18h。
36.s11:打开冻干机，预冻4 h后，将s10中的支架真空冷冻（-75℃～-80℃）干燥48h确保水分全部去除。制得3d多孔壳聚糖/羧甲基纤维素钠支架（即用于肿瘤侵袭能力检测的支架），并置于干燥器中备用。
37.将实施例1制得的3d多孔壳聚糖/羧甲基纤维素钠支架上进行红外光谱分析：分别将壳聚糖、羧甲基纤维素钠、壳聚糖/羧甲基纤维素钠3d支架置于红外光谱仪上，检测三种物品的红外光谱，并进一步分析，结果如图8所示，图8中a为壳聚糖中，在3300多中附近出现羟基（o-h）和氨基（n-h）的伸缩振动吸收峰，在1500-1635处附近存在是氨基（n-h）的变形振动吸收峰，在1100多附近存在（c-o）的伸缩振动吸收峰。b为羧甲基纤维素钠中，3300附近出现羟基（o-h）伸缩振动吸收峰，1600-1800处属于羰基（c=o）的伸缩振动峰，在1400多处属于离子化羧基的c-o的伸缩振动，1300-1080分别对应c-o的弯曲振动和羟基c-o的伸缩振动。c为在复合支架中，在3500存在羟基（o-h）的伸缩振动吸收峰，在1100存在c-o的弯曲振动吸收峰，在1600附近可以观察到酰胺的羰基（c=o）的伸缩振动吸收峰，由此可以说明，壳聚糖和羧甲基纤维素钠通过酰胺化反应发生交联，得到复合支架。最终得出壳聚糖与羧甲基纤维素钠发生酰胺反应生成酰胺键，表明材料合成成功。
38.将实施例1制得的3d多孔壳聚糖/羧甲基纤维素钠支架上进行肝癌细胞培养：（1）huh7肝癌细胞复苏离心并重悬于dmem培养基中（含10％fbs和 1％青链霉素溶液），于37
°
c、5% co2细胞培养箱中培养至细胞汇合达到约80%时，通过胰蛋白酶消化和离心获得细胞悬液；（2）将3d多孔壳聚糖/羧甲基纤维素钠支架用酒精浸泡1h同时使用紫外灯车照射1h，而后加入pbs洗涤3次，加入完全培养基浸泡过夜，最后接种细胞，待细胞贴壁后补充培养基，在37
°
c、5% co2 培养箱中培养；（3）分别在培养1、3、5、7d后将支架进行cck-8细胞增殖实验，以普通24孔板培养为对照，并在450nm处测量od值；结果如图4所示，图4表明随着时间的增长，所合成的支架具有良好的生物相容性，而且伴随着复合多孔支架的降解，这些降解的有机物可以被细胞很好的吸收，进一步的促进细胞增殖，提示所合成的复合多孔支架将更有利于观察癌细胞的侵袭情况。
39.（4）分别在培养1、3、5、7d后将支架进行活/死细胞染色，并使用荧光显微镜进行观察，绿色为活细胞，红色为死细胞；结果如图5所示。图5展示了同图4相同的结果：该复合多孔支架可以很好的促进细胞的增殖，从图像上可以更加直观地了解到细胞的分布和生长状况。
40.（5）培养7d后将支架以及支架上的细胞首先使用组织固定液进行固定15min，使用pbs溶液冲洗支架3-5遍以去除组织固定液，而后进行分别进行细胞核和f-actin染色。首先是要将固定好的支架浸泡在鬼笔环肽标记的fitc染料中30min，使用pbs溶液反复冲洗3-5遍以去除未结合的染料。然后将支架浸泡在dapi溶液中15min以标记细胞核，使用pbs溶液反复冲洗3-5遍以去除未结合的染料。最后，使用组织冷冻切片机将支架层切成100um厚的组织切片，将切片置于荧光显微镜下观察，结果如图6所示，通过观察不同层数的细胞分布从而分析癌细胞侵袭的情况以及具体机制。图6展示了在距离支架表面200-300um处癌细胞的迁移情况，而且通过dapi染色和细胞骨架的染色，我们可以进一步进行细胞定位并观察细胞在该位置处的骨架铺展情况。
41.（6）培养7d后将支架进行固定以及脱水处理，首先使用pbs清洗支架两次，然后使用5%戊二醛溶液对细胞进行固定，时间约40min。待细胞固定完成后，进行细胞脱水处理。运用常见的梯度脱水的方法，分别使用50%、60%、70%、80%、90%酒精溶液以及无水乙醇浸泡
10min，最后将无水乙醇吸出，将支架置于通风橱内过夜待自然风干后进行下一步的操作。使用组织切片机支架层切成100um厚的薄片，并将层切后的支架表面进行喷金处理，而后送入扫描电子显微镜内可以观察到支架表面形貌以及支架内部的侵袭情况。如图7所示，我们选取了距离支架表面400-500um处的支架切面，扫描电子显微镜的结果表明：该复合多孔支架还原了癌细胞在体内的组织中的生长和侵袭状态。其中癌细胞形态接近于圆球状或椭球状，表现出成堆聚集生长的特性。进一步的，箭头标注位置表示，即使在支架孔隙边缘，癌细胞依旧能够很好的黏附生长，并为后续的癌细胞集体侵袭做好铺垫。总的来说，本专利中所设计的多孔复合支架可以很好的观察到不同层面的细胞铺展和迁移情况。