一种裂解性多糖单加氧酶及其应用的制作方法

：本发明属于基因工程和生物。具体地，本发明涉及一种提高曲霉降解淀粉能力的方法，具体涉及曲霉的遗传改造，更具体的涉及锥毛壳属真菌coniochaetasp.pmi_546裂解性多糖单加氧酶cospaa13及其基因在提高曲霉降解淀粉能力中的应用。

背景技术

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背景技术：

1、丝状真菌蛋白质生产系统发展潜力巨大、应用前景广阔，它作为细胞工厂可高效表达分泌胞外蛋白，被广泛用作细胞工厂，生产许多有价值的产品。黑曲霉(aspergillusniger)是一种常见的曲霉属丝状真菌，其生命力旺盛，菌株繁殖快。其分泌效率高、翻译后修饰能力强，被广泛用作蛋白质生产的细胞工厂，是工业上生产酶制剂的主要菌株，生产工业酶和有机酸等。

2、糖化酶(glucoamylase，ec 3.2.1.3)全称为葡萄糖淀粉酶，是最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于制糖、发酵和食品加工等众多领域，我国糖化酶主要是由黑曲霉菌株经深层发酵生产。我国糖化酶工业生产起步较晚，经过几十年的不断发展，取得了明显的进步。目前已经可以自主生产糖化酶等大宗酶制剂品种，例如中国专利文献cn105255741a公布了一株以黑曲霉g131和f285为出发菌株，通过多轮原生质体电融合育种选育获得的高产糖化酶的菌株-黑曲霉cgmcc 10788，该菌株平均发酵酶活力比出发菌株提高了99.3％。公开号为cn103937766 a的发明专利公开了一种通过将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉an12g08830基因座，从而提高糖化酶的方法。公开号为cn113061539a的发明专利公开了通过对脂肪酸代谢通路基因过表达从而提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法。

3、尽管这些研究也已经达到了很高的水平，但是目前的研究主要集中在利用传统的菌种选育方法进行高产糖化酶菌株的筛选育种，或者是在原有的黑曲霉菌株中提高糖化酶基因的拷贝数或者去除某些基因。近年来裂解性多糖单加氧酶(lpmo)的发现为淀粉降解提供了一种新的方式。因此，有必要开发一种利用裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用提高糖化酶活力的菌株，显著提高重组菌株的淀粉降解能力，以满足我国糖化酶在工业领域的发酵应用，具有重要的创新性。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本申请经过广泛而深入的研究，目的在于提供一种利用裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用提高菌株糖化酶活力的菌种改造方法，通过遗传改造提高丝状真菌菌株的糖化活力。本发明通过将裂解性多糖单加氧酶基因随机插入整合到黑曲霉菌株的基因组中，发挥裂解性多糖单加氧酶和糖化酶的协同作用，显著提高重组菌株的糖化活力。在此基础上，完成了本发明。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、本发明提供的技术方案之一，是一种曲霉重组菌，所述重组菌是在具有糖化酶的曲霉出发菌中表达裂解性多糖单加氧酶cospaa13所得；

4、进一步地，所述曲霉为黑曲霉；

5、进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶cospaa13来源于锥毛壳属真菌coniochaetasp.pmi_546，具有seq id no.1所示的氨基酸序列；

6、更进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶cospaa13的编码基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列；

7、进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶cospaa13的表达可以是在宿主基因组中整合cospaa13编码基因或含有cospaa13编码基因的表达盒，也可以将包含cospaa13编码基因表达盒的表达载体转入宿主细胞中实现；

8、优选地，所述重组菌是在产糖化酶的黑曲霉工业菌株un1636中，通过pan52-tn载体重组表达裂解性多糖单加氧酶cospaa13获得的，重组菌命名为cospaa13-2菌株；

9、进一步地，所述黑曲霉菌株un1636，保藏编号cgmcc no.20725；

10、上述重组菌是一种裂解性多糖单加氧酶与糖化酶发挥协同作用的菌株，其与出发菌株相比，获得更强的糖化酶活力和淀粉降解的能力。

11、本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述重组菌的应用，特别是在降解淀粉中的应用。

12、本发明获得下述有益效果：

13、对曲霉细胞进行遗传操作实现裂解性多糖单加氧酶的重组表达，所得重组菌是一种裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用的菌株，其与出发菌株相比，获得更强的糖化酶活力和淀粉降解的能力，显著提高重组菌株的糖化活力。本发明利用基因重组技术表达裂解性多糖单加氧酶cospaa13，得到重组曲霉突变菌株，该突变菌株能够显著提升淀粉降解能力，糖化酶的活力比出发菌提高22.8％，具有较大的应用价值。

技术特征：

1.一种曲霉重组菌，其特征在于，所述重组菌是在具有糖化酶的曲霉出发菌中表达裂解性多糖单加氧酶cospaa13所得；

2.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶cospaa13的编码基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶cospaa13的表达可以是在宿主基因组中整合cospaa13编码基因或含有cospaa13编码基因的表达盒，也可以将包含cospaa13编码基因表达盒的表达载体转入宿主细胞中实现。

4.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述曲霉为黑曲霉。

5.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述重组菌是在产糖化酶的黑曲霉工业菌株un1636中，通过pan52-tn载体重组表达裂解性多糖单加氧酶cospaa13获得的。

6.权利要求1-5任意一项所述曲霉重组菌的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是在降解淀粉中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及一种提高曲霉降解淀粉能力的方法，具体涉及曲霉的遗传改造，更具体的涉及锥毛壳属真菌Coniochaeta sp.PMI_546裂解性多糖单加氧酶CospAA13及其基因在提高曲霉降解淀粉能力中的应用。本发明所提供的CospAA13重组表达的菌株，该菌株中的CospAA13与糖化酶协同作用，显著提升淀粉水解能力。其中糖化酶活力比出发菌株提高了22.8％，具有较高的应用价值。

技术研发人员：王兴吉,张杰,钱娟娟,王克芬,郭文柱,刘文龙
受保护的技术使用者：山东隆科特酶制剂有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12