草酸青霉基因工程菌gxur001及其在制备生淀粉酶制剂中应用
技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，尤其涉及一种草酸青霉基因工程菌gxur001及其在制备生淀粉酶制剂中应用。
背景技术：
：：2.21世纪是一个全球工业化、城市化的时代。为了贯彻人与自然和谐共生、绿色发展的理念，可再生能源不仅可满足人们日益增长的能源需求，还可以有效解决环境污染等问题。可再生能源主要包括太阳能、风能、水电、地热能和生物质能。其中，生物质能发展潜力巨大。生物质能具有可再生、原料廉价等优势。3.以生物质为原料生产的生物燃料乙醇是一种重要的生物质能，根据原料的不同，生物燃料乙醇大致可以分为三代：第一代以蔗糖和淀粉为主要原料，第二代以木质纤维素为主要原料，第三代以藻类为主要原料。由于以木质纤维素和藻类为原料生产生物燃料乙醇成本太高，目前工业上仍以第一代生物燃料乙醇为主。4.我国用于生产生物燃料乙醇的淀粉主要来源于陈化粮(如大米、小麦、玉米等)以及木薯淀粉等。传统工艺中，淀粉加工主要分为两步：首先生淀粉在高温(100℃左右)和α-淀粉酶作用下进行糊化、液化，然后在50-60℃条件下，通过糖化酶水解为葡萄糖。该工艺流程复杂、耗能高，且污染环境(cripwellra,rosesh,favarol,etal.,constructionofindustrialsaccharomycescerevisiaestrainsfortheefficientconsolidatedbioprocessingofrawstarch.biotechnolbiofuels.2019,12:201)。非常有必要开发更高效、更节能的淀粉加工工艺。5.研究人员发现生淀粉酶能在淀粉糊化温度以下，将生淀粉直接水解为葡萄糖，从而省去高温糊化和液化步骤，减少能源输入、降低成本。生淀粉酶主要包括生淀粉糖化酶、α-生淀粉酶和β-生淀粉酶，主要来源于丝状真菌，如曲霉和青霉。但是，丝状真菌的生淀粉酶产量低，成本高，远远达不到工业生产水平。通过真菌育种包括诱变育种和分子育种，是目前提高生淀粉酶产量、降低成本最有效的途径(zhaosf,xiangby,yangl,etal.,geneticmodificationsofcriticalregulatorsprovidenewinsightsintoregulationmodesofraw-starch-digestingenzymeexpressioninpenicillium.biotechnolbiofuelsbioprod.2022,15:62)。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是提供一种高产生淀粉酶的草酸青霉基因工程菌gxur001及其在制备生淀粉酶制剂中应用。7.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：8.草酸青霉基因工程菌gxur001，保藏编号为cctccno:m2022120，分类命名为草酸青霉(penicilliumoxalicum)te4-10δcxrc::amyr。9.上述草酸青霉基因工程菌gxur001在水解生淀粉或含生淀粉物质中的应用。10.生淀粉为生木薯粉、生玉米粉、生大米粉、生马铃薯粉、生小麦粉等含有生淀粉的农业有机物。11.上述草酸青霉基因工程菌gxur001在制备生淀粉酶制剂中的应用。12.生淀粉酶制剂，该制剂中的活性成分来自权利要求1草酸青霉基因工程菌gxur001或者其培养发酵物。13.上述生淀粉酶制剂的制备方法，用液体发酵培养基在28℃，180rpm下培养权利要求1草酸青霉基因工程菌gxur001，收集发酵产物，即得。14.液体发酵培养基按以下进行配制：麦麸、结晶avicel与盐溶液的配比为2g:3g:100ml，每100ml盐溶液中含有0.4g(nh4)2so4,0.4gkh2po4,0.06gmgso4·7h2o,0.06gcacl2,tween-800.2ml,100μl微量元素母液，ph5.5；上述微量元素母液中每1l含有5gfeso4·7h2o,1.6gmnso4·h2o,1.4gznso4·7h2o,2.0gcocl2。15.培养的条件为28℃，180rpm，8d。16.水解生淀粉或含生淀粉物质的方法，将上述生淀粉酶制剂加入生淀粉或含生淀粉物质进行水解生淀粉的反应。17.反应条件为ph4.5、65℃。18.上述生淀粉酶制剂用于制备葡萄糖、燃料乙醇19.针对目前生淀粉酶产量低、成本高的问题，发明人经分离、筛选获得了一株草酸青霉基因工程菌gxur001，保藏编号为cctccno:m2022120，分类命名为草酸青霉(penicilliumoxalicum)te4-10δcxrc::amyr。草酸青霉gxur001是在草酸青霉突变菌株a2-13基础上，通过4轮ems化学诱变和2轮co60-γ射线诱变得到突变菌株te4-10，再在菌株te4-10中同时敲除转录抑制基因poxcxrc、过表达转录激活基因poxamyr而获得的。试验证明，本发明的草酸青霉gxur001液体培养后，其发酵液具有生淀粉酶活力，包括生木薯淀粉酶活力、生玉米淀粉酶活力、生小麦淀粉酶活力、生大米淀粉酶活力。使用其发酵液可以高效水解未处理的生木薯淀粉产生葡萄糖，在生木薯淀粉转化和利用中具有应用潜力。因此，本发明草酸青霉gxur001可以用于生产生淀粉酶制剂，该制剂可以高效地水解未处理的生木薯淀粉用于制备葡萄糖、燃料乙醇。附图说明20.图1是草酸青霉诱变过程中所得突变菌株生淀粉酶产量比较图。21.图2是本发明草酸青霉基因工程菌gxur001的构建示意图。22.图3是本发明构建草酸青霉基因工程菌gxur001的验证结果图，图中：m：1kbdnamarker，1:ddh2o，2:te4-10，3-5:3个gxur001转化子。23.图4是本发明构建草酸青霉基因工程菌gxur001产生淀粉酶水解生木薯淀粉的效率曲线图，图中：a：水解生木薯粉释放葡萄糖的浓度，b：生木薯淀粉的水解率，c：水解生玉米粉释放葡萄糖的浓度，d：生玉米淀粉的水解率。24.保藏信息说明25.草酸青霉(penicilliumoxalicum)te4-10δcxrc::amyr，保藏编号为cctccno:m2022120，保藏日期：2022年02月16日，保藏地址为：中国武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。26.保藏条件：低温冷冻(-70℃)。具体实施方式27.下面结合具体实例对本发明进一步详细描述。其中，如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到；所用麦麸为小麦麦麸，含水量在5％以下。28.以下葡萄糖标准曲线的绘制、生木薯淀粉酶活力的测定均按照如下方法进行：29.1.葡萄糖标准曲线的绘制30.取0.05g葡萄糖标准品到50ml容量瓶中，通过去离子水定容，得到浓度为1mg/ml葡萄糖标准溶液母液。按表1配方，将各种试剂加入到2mlep管中，混匀，沸水浴5分钟，取出样品冷却至室温。在12,000rpm，1min条件下离心，取200μl上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定其吸光值，并绘制葡萄糖标准曲线，得到线性回归方程为y＝3.297x-0.0318，方差r2＝0.9993。31.表1葡萄糖标准曲线溶液的配制[0032][0033]2.生天然木薯淀粉酶活力的测定[0034](1)制备粗酶液：用四层纱布过滤发酵培养液，将滤液放到10mlep管中，8000rpm，4℃，离心10min。取上清液，即为粗酶液。用na2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph4.5)适当稀释，作为实验组酶液。[0035](2)制备对照组酶液：取一定量的待测酶液到2ml离心管中，沸水浴15min，作为对照组酶液。[0036](3)制备水解底物：称取1g生木薯淀粉到100mlna2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph4.5)中，制备1％生天然木薯淀粉溶液。取0.45ml到2.0mlep管中，作为水解底物，置于65℃水浴锅中，预热5min。[0037](4)向预热好的底物中，加入50μl实验组酶液，三个平行，对照组中加入50μl对照组酶液，在65℃水浴条件下，水解30min。[0038](5)步骤(4)结束后，加入1mldns，在100℃沸水中5min，充分显色后在冰上进行冷却。[0039](6)取200μl步骤(5)中的溶液到96孔板中，在540nm处测定其吸光值。根据以上葡萄糖标准曲线方程，计算得到还原糖浓度，继而通过酶产量计算公式，得到生淀粉酶产量。[0040]生淀粉酶产量(u/ml)＝反应体系体积×反应体系中葡萄糖浓度×稀释倍数×1000/葡萄糖相对分子质量/反应时间/加入酶液体积。[0041]一个酶活力单位(u)定义为：在ph4.5、65℃反应条件下，生天然木薯淀粉酶水解生天然木薯淀粉，每1分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。[0042]ph为4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制：[0043]0.1m柠檬酸溶液：取19.2g柠檬酸溶于1l去离子水中。[0044]0.2m磷酸氢二钠溶液：取28.4g磷酸氢二钠溶于1l去离子水中。[0045]取适量的0.1m柠檬酸溶液和0.2m磷酸氢二钠溶液，在ph指示计下，调节到ph至4.5。[0046]实施例一、草酸青霉基因工程菌gxur001的构建[0047]1.草酸青霉突变株te4-10的获得[0048]草酸青霉gxur001是以草酸青霉突变菌株a2-13(保藏编号：cctccno：m2020319)为出发菌株，通过2轮甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfonate,ems)化学诱变，得到了一株生淀粉酶产量较出发菌株a2-13提高的突变株te2-23，再将te2-23经过2轮co60-γ射线辐照，得到了一株更高的生淀粉酶产量的突变株co2-12。再将突变株co2-12进行2轮ems诱变，筛选得到突变株te4-10。[0049]具体操作：将出发菌株a2-13进行ems化学诱变时，处理10h，其致死率为96.2％。在此条件下，进行突变与筛选，得到了突变菌株te2-23；将菌株te2-23进行co60-γ射线辐照时，选择致死率为87.2％的对应剂量，进行突变与筛选，获得突变菌株co2-12；再将突变株co2-12孢子悬液进行ems处理，最终获得突变菌株te4-10。[0050]经测定比较，诱变过程中所得突变菌株生淀粉酶产量如图1所示。[0051]2.用于构建草酸青霉基因工程菌的dna盒的构建[0052]poxcxrc和poxamyr分别是草酸青霉中负向和正向调控生淀粉酶产量的转录阻遏因子和激活因子(zhangt,mairm,fangqq,etal.,regulatoryfunctionofthenoveltranscriptionfactorcxrcinpenicilliumoxalicum.molecularmicrobiology,2021,116(6):1512-1532；liz,yaog,wur,etal.,synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninpenicilliumoxalicum.plosgenetics,2015,11(9):e1005509)。[0053]用于构建草酸青霉基因工程菌的dna盒自上游至下游依次由poxcxrc同源左臂、博来霉素抗性基因ble、poxamyr全长基因序列包括启动子区、开发阅读框、终止子区和poxcxrc同源右臂组成。poxcxrc同源左臂如序列表的seq.no.id.1所示；ble基因如序列表的seq.no.id.2所示；poxamyr全长基因如序列表的seq.no.id.3所示；poxcxrc同源右臂如序列表的seq.no.id.4所示。[0054]3.草酸青霉基因工程菌株gxur001的构建(如图2所示)[0055]①吸取6μl100mm亚精胺水溶液，到dna盒中(20μg)，混匀后加入100μl突变体te4-10原生质体中，混合均匀，冰上静置30min。[0056]②在步骤1中加入1mlptc溶液，混合均匀，室温静置25min。[0057]③在步骤2中2mlstc溶液，混合均匀，将混合液加入到20ml再生培养基中，混合均匀，然后将混合液倒入灭菌的培养皿中(每个培养皿倒入5ml左右)；待完全凝固后，放置28℃的培养箱中培养1h，再加入35ml带有博来霉素抗性的pda培养基(博来霉素的含量为100μg/ml)覆盖其表面；待完全凝固后，放入28℃培养箱中，倒置培养3-4d。starch-degradingglucoamylaseinpenicilliumoxalicumusingstrongpromoterandsignalpeptide.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2018,102:9291–9301.[0076]3、linhj,xianl,zhangqj,etal.,productionofrawcassavastarchdegradingenzymebypenicilliumanditsuseinconversionofrawcassavaflourtoethanol.journalofindustrialmicrobiologyandbiotechnology,2011,38:733–742.[0077]4、jiangt,caim,huangm,etal.,characterizationofathermostableraw-starchhydrolyzingα-amylasefromdeep-seathermophilegeobacillussp.proteinexpressionandpurification,2015,114:15-22.[0078]5、karimkmr,husainia,singnn,etal.,characterizationandexpressioninpichiapastorisofarawstarchdegradingglucoamylase(ga2)derivedfromaspergillusflavusnsh9.proteinexpressionandpurification,2019,164:105462.[0079]实施例三、利用生淀粉酶制剂水解生淀粉[0080]1.生木薯淀粉的制备[0081]将从农贸市场买来的木薯切块晾干，再用粉碎机将木薯块粉碎，过80目筛；用去离子水水洗木薯粉，直至上清液透明澄清；再将水洗好的木薯粉在55℃烘箱中烘干至恒重；粉碎，过80目筛，用保鲜袋装好，放在干燥通风处备用。[0082]2.草酸青霉gxur001生淀粉酶制剂水解生淀粉的效率[0083]反应体系为50ml，底物(生木薯粉/生玉米粉)浓度设置为150g/l，生淀粉酶添加量为100、150、250u/g三个梯度(生淀粉酶活力以生木薯淀粉酶活力来计)。[0084]反应体系具体制备方法为：称取7.5g处理过的生木薯/玉米粉到na2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph4.5)，再加入实施例2的生淀粉酶制剂。在40℃，180rpm条件下反应120h。分别在反应24、48、72和96h取样，检测反应体系中还原糖的含量，计算生淀粉的水解率。[0085]生淀粉水解率＝葡萄糖的重量*0.9*100/生木薯淀粉中淀粉的重量。[0086]结果见图4，表明酶添加量为250u/g时，水解生木薯粉120h时，释放的葡萄糖浓度为117.2g/l，生木薯淀粉的水解率达到93.04％；水解生玉米粉84h时，释放的葡萄糖浓度为126.1g/l，生玉米淀粉的水解率为100％。当前第1页12当前第1页12