基于MALDI-TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物、探针、试剂盒和方法与流程

本发明涉及生化检测，尤其涉及基于maldi-tof质谱检测七种猪呼吸道病毒的pcr引物、探针、试剂盒和方法。

背景技术：

1、猪病毒性呼吸道疾病和繁殖障碍疾病是制约现代养猪业规模化和集约化发展的重要因素，不同猪呼吸道及繁殖障碍疾病在猪群间常出现混合感染和继发感染，并呈地方流行性发生，而其中80％以上的猪病为两种或两种以上病原体造成，例如猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，pcv-2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3，pcv-3)、猪博卡病毒(porcine bocavirus，pbov)和非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)等。pcv、pbov可引起猪只呼吸系统疾病，pcv、prv可导致猪只繁殖障碍性疾病的发生；而asfv可导致猪只感染高度接触性传染病非洲猪瘟(african swine fever)，其强毒株致死率100％，且病原学和流行病学十分复杂。由于这些病原体导致的猪病发病机制与临床症状较为相像，给疫病防控带来较大阻碍，也使得多种病原体的高通量快速检测成为疫病防控的重点环节。

2、我国养猪市场巨大，据统计，我国生猪养殖量占世界生猪总养殖量的40％以上，生猪饲养产值接近1.3万亿。随着生猪养殖业规模化和集约化程度的提高，猪病混合感染的几率也随之增加。此外，近年来由于猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒等新发疫病在国内外流行范围的扩大以及非洲猪瘟等重大疫情的传播，加之部分病原体不同基因型病原体所引起的混合感染等，使得疫病防控难度进一步增大。此时若使用多种单目标检测方法对样本逐一进行检测，检测周期与成本都将大大增加，开发多目标高通量检测方法，提升检测诊断效率，将为疾病防控提供更强有力的保障。

3、目前动物疫病多重分子诊断技术主要以多重pcr方法、多重taqman或sybr green荧光定量rt-pcr方法及gexp多重pcr技术为主，如本技术的申请人申请的中国发明专利(公开号：cn105936944a，公开日：20160914)公开了一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒h1亚型的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针，该方法实现在猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。申请人申请的中国发明专利(公开号：cn113322352a，公开日：20210831)公开了一种三重数字微滴pcr检测猪圆环病毒的方法、引物、探针和试剂盒，该方法基于ddpcr的优势，建立猪圆环病毒不同基因型的高灵敏、精确鉴别检测方法，可应用于常规动物检疫以及饲料、肉制品、疫苗等病毒含量低、基质复杂的动物源产制品的检疫监测和载量滴定。多重pcr方法的敏感性及特异性相较荧光方法较低，且退火温度容易受到扩增片段长度的影响；荧光定量的检测方法虽然具有高度的特异性和敏感性，检测时间短，但存在荧光通道的限制及多重引物间的交叉反应性，极大地限制了多重荧光定量pcr方法同时检测四重及以上的靶标的能力；gexp多重rt-pcr技术则由于毛细管电泳灵敏度过高，可能造成检测结果假阳性。

4、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)是一种新型生物大分子检测技术，它将生物大分子与基质分子结合生成共结晶，在激光轰击后根据质荷比对分析样本进行区分和检测。即通过与多重pcr联用，针对扩增后的多靶标核酸片段，分别设计对应的延伸探针(uep)进行单碱基延伸，延伸后的产物经maldi-tof ms分析检测，得到不同特异性核酸片段的质量信号，从而对同一样本进行多靶标同步鉴别检测。maldi-tof ms技术最多一次可同时对2×386个样本进行多目标检测，每个反应最多可检测40个靶目标，大大提高了检测鉴定的效率。

5、maldi-tof ms在病原微生物的临床检测中已有较多应用，并在病原体高通量检测及分型诊断中展现出良好的前景。liu等人建立了可以同时检测和区分7种人类冠状病毒(hcov)的核酸质谱检测方法，检测限为1-5个拷贝/反应，为hcov的大规模筛查提供了技术平台；刘宏钱等人建立了人呼吸道症候群相关病毒maldi-tof ms多目标检测技术，可同时对27种呼吸道病原体进行检测，灵敏度达10～1000拷贝/μl。在动物疫病诊断方面，liu等人建立了10种鸭源性致病病毒的maldi-tof ms同步检测方法，体系的最低检测限均可达10拷贝/μl。但是，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)在猪多种病原体的高通量快速检测，目前还没有公开报道。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明针对prv、pcv-2、pcv-3、pbov-g1、pbov-g2、pbov-g3和asfv等常见的猪呼吸道dna病毒设计多重引物及uep探针，建立了能同步鉴定7种常见猪呼吸道病毒的maldi-tof ms高通量多目标技术体系，为猪群相关疫病监测和鉴别诊断以及进出口动物检疫提供了一种新的高效手段。

2、为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、一种基于maldi-tof质谱检测七种猪呼吸道病毒的pcr引物和探针，所述七种猪呼吸道病毒为猪伪狂犬病毒prv、猪圆环病毒2型pcv-2、猪圆环病毒3型pcv-3、猪博卡病毒1型pbov-g1、猪博卡病毒2型pbov-g2、猪博卡病毒3型pbov-g3和非洲猪瘟病毒asfv，其中：

4、猪伪狂犬病毒prv的pcr引物的序列为seq id no.1、seq id no.2所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.15所示；

5、猪圆环病毒2型pcv-2的pcr引物的序列为seq id no.3、seq id no.4所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.16所示；

6、猪圆环病毒3型pcv-3的pcr引物的序列为seq id no.5、seq id no.6所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.17所示；

7、猪博卡病毒1型pbov-g1的pcr引物的序列为seq id no.7、seq id no.8所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.18所示；

8、猪博卡病毒2型pbov-g2的pcr引物的序列为seq id no.9、seq id no.10所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.19所示；

9、猪博卡病毒3型pbov-g3的pcr引物的序列为seq id no.11、seq id no.12所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.20所示；

10、非洲猪瘟病毒asfv的引物pcr序列为seq id no.13、seq id no.14所示，uep延伸探针的引物序列为seq id no.21所示。

11、作为优选，上述seq id no.1-seq id no.24所示的每条pcr引物的5′端加入10个碱基的tag，tag的序列为acgttggatg。

12、进一步，本发明还公开了一种基于maldi-tof质谱检测七种猪呼吸道病毒的试剂盒，该试剂盒包括所述的pcr引物和探针。

13、作为优选，该试剂盒还包括进行反转录和pcr反应所需的试剂。

14、作为优选，pcr引物的浓度为0.5-0.7μm，uep延伸探针的浓度为3.5-6.5μm；再优选，猪伪狂犬病毒prv的pcr引物的浓度为0.6μm，猪圆环病毒2型pcv-2的pcr引物的浓度为0.7μm、猪圆环病毒3型pcv-3的pcr引物的浓度为0.7μm、猪博卡病毒1型pbov-g1的pcr引物的浓度为0.6μm、猪博卡病毒2型pbov-g2的pcr引物的浓度为0.6μm、猪博卡病毒3型pbov-g3的pcr引物的浓度为0.5μm，非洲猪瘟病毒asfv的pcr引物的浓度为0.5μm；猪伪狂犬病毒prv的延伸探针的浓度为6μm，猪圆环病毒2型pcv-2的延伸探针的浓度为5μm、猪圆环病毒3型pcv-3的延伸探针的浓度为5μm、猪博卡病毒1型pbov-g1的延伸探针的浓度为5μm、猪博卡病毒2型pbov-g2的延伸探针的浓度为3.5μm、猪博卡病毒3型pbov-g3的延伸探针的浓度为6.5μm、非洲猪瘟病毒asfv的延伸探针的浓度为5μm。

15、进一步，本发明还公开了所述的pcr引物和探针在制备基于maldi-tof质谱检测七种猪呼吸道病毒的试剂盒中的应用，所述七种猪呼吸道病毒为猪伪狂犬病毒prv、猪圆环病毒2型pcv-2、猪圆环病毒3型pcv-3、猪博卡病毒1型pbov-g1、猪博卡病毒2型pbov-g2、猪博卡病毒3型pbov-g3和非洲猪瘟病毒asfv。

16、进一步，本发明还公开了一种基于maldi-tof质谱检测七种猪呼吸道病毒的方法，所述的方法为非疾病诊断方法，所述的七种猪呼吸道病毒，所述七种猪呼吸道病毒为猪伪狂犬病毒prv、猪圆环病毒2型pcv-2、猪圆环病毒3型pcv-3、猪博卡病毒1型pbov-g1、猪博卡病毒2型pbov-g2、猪博卡病毒3型pbov-g3和非洲猪瘟病毒asfv，该方法采用所述的pcr引物和探针或所述的试剂盒进行检测。

17、作为优选，该方法包括以下的步骤：

18、1)多重pcr反应：将样本与pcr引物混合液进行混合，进行多重pcr反应；

19、2)sap消化反应：将扩增后的产物用虾碱性磷酸酶将pcr步骤中多余的脱氧核糖核苷三磷酸消化为ddntp，最后灭活；

20、3)延伸反应：将消化后的产物加入延伸探针进行延伸反应；

21、4)将反应结束后的延伸产物转至多孔板，放入质谱仪，加入树脂进行脱盐处理后进行质谱检测；数据采集及分析由massarray typer软件完成。

22、作为再优选，步骤1)多重pcr反应的反应程序为95℃2min，随后95℃15s、60℃30s和72℃60s进行40个循环，最后72℃5min；步骤2)将扩增后的产物用虾碱性磷酸酶补至7μl，37℃40min将pcr步骤中多余的脱氧核糖核苷三磷酸消化为ddntp，最后85℃灭活5min；步骤3)消化产物中加入1μl延伸探针，0.2μl inplex buffer及0.2μl termination mix，用ddh2o补至9μl；反应程序为95℃30s，95℃5s，52℃5s，80℃5s进行40个循环，最后在72℃延伸3min；步骤4)将反应结束后的延伸产物转至384孔板，用ddh2o补至25μl，10000r/min离心2min。

23、作为优选，该方法还包括以下步骤：分别取0.5g样品，冻融3次后充分研磨，按1：10置于pbs缓冲液，10000r/min离心5min后取上清；全血样品冻融3次后，10000r/min离心5min后取上清；按核酸提取仪np968-c配套试剂说明书进行核酸的纯化提取，并于-20℃保存备用。

24、本发明根据7种病原体基因的保守序列，分别设计7对引物及对应的单碱基延伸探针，通过引物浓度和反应条件优化，建立了常见猪呼吸道dna病毒的核酸质谱(maldi-tofms)多目标检测体系。maldi-tof ms与多重pcr联用技术，可使用质谱手段得到多个特异性核酸片段的质量信号，从而对同一样本进行多靶点检测。通过对产物在4000～10000道尔顿的质量范围进行分析，不但避开了多重pcr产物中的可能存在的引物二聚体及非特异性扩增产物，同时在延伸阶段通过单碱基延伸进一步提高了检测体系的特异性，在弥补了多重pcr缺陷的同时保持了质谱检测的灵敏度。此外，由于多重pcr与maldi-tof ms联用检测体系中引物及延伸探针干扰性较小，使得体系具有很好的扩充性，在更换部分引物及延伸探针的并优化引物浓度后，可进一步增加用于检测的靶点，以扩大检测体系所包含的病原体种类，能够满足对多种类病原体快速、高通量检疫的要求。

25、通过对本发明建立的maldi-tof ms体系进行方法学验证，结果显示该方法稳定性与特异性好。质谱分析显示，多目标检测体系的7种靶标产物峰，只在特定病毒阳性样品检测时产生，与其它病原体检测无交叉反应，均未出现产物峰，表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示，体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性均符合率≥98.0％，批间均≥98.3％，表明该方法重复性良好。以标准质粒为模板的检测灵敏性试验分析显示，体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65～26.27拷贝/μl之间，与荧光pcr检测方法相当。

26、应用maldi-tof ms体系对总计108份样品进行检测，其中34份组织及全血疑似病料样品的混合感染率为54.76％，表明多种病毒性呼吸道疾病和繁殖障碍疾病病原体在患病猪只及猪群中造成的混合感染较为普遍，其中以pcv-2混合感染最多，高达67.6％；pbov-g1、g2、g3三种基因型总检出率为47.6％(20/46)，其中与别种病原体的混合感染占到95％(19/20)。24份猪肉样品中检出pcv-2、pcv-3阳性(16.7％、35.7％)，混合感染率为29.17％，提示当前猪肉市场中存在一定程度的猪圆环病毒污染。而含猪源成分饲料作为深加工制品，原本猪肉含量不高，并且存在部分病毒在加工处理阶段被清除的因素，42份饲料样本中阳性检出率及混合感染率均最低，分别为42.9％和21.43％。养殖和流通环节样本中病原体的高混合感染率。此外，该体系对样本检测的通量大，最大可同时上样768个，可用于批量样本的规模化检测。

27、将108份样品的maldi-tof ms方法检测结果，与数字pcr及荧光pcr方法检测结果进行对比验证，结果显示7种靶标阳性检出的总符合率与荧光pcr、数字pcr结果基本相符(94.4％～100％)，差异主要体现在数字pcr对pcv-2、pcv-3的饲料检测上(94.4％，96.3％)，而与荧光pcr对prv、pbov-g1、pbov-g2、pbov-g3、asfv的符合率较高(100％，99.1％，97.2％，100％，100％)。其原因可能是由于数字pcr检测的灵敏度更高，理论上可对样本靶标进行单拷贝检测，即使在病毒核酸含量极低的样本中也能检出，更适宜对饲料等此类含复杂基质的样本进行检测。

28、本发明通过核酸质谱(maldi-tof ms)技术建立了同步鉴定prv、pcv-2、pcv-3、pbov-g1、pbov-g2、pbov-g3和asfv 7种猪呼吸道dna病毒的多目标检测体系，具有高通量、高灵敏度、特异性强的特点，为猪群相关疫病监测和鉴别诊断以及进出口动物检疫提供了便利。