一种基于仲醇脱氢酶定向进化的癸二酸合成体系中NADPH原位再生系统的构建方法

本发明涉及蛋白质工程和酶催化领域，具体涉及通过对多酶共催化合成癸二酸体系中的仲醇脱氢酶进行定向进化，将其辅因子偏好性由nad+转变为nadp+，使其与下一级反应的单加氧酶(bvmo)的辅因子相匹配，实现体系内单辅因子催化及辅因子nadp+/nadph再生自循环。

背景技术：

0、技术背景

1、长链α,ω-二元羧酸(α,ω-dca)被频繁和广泛地用于生产各种化学品和中间体，在医药、香料，尤其是高分子领域具有广泛应用。传统工业生产中，α,ω-dca由石化原料或特殊脂肪酸(蓖麻酸)经氧化裂解制得，反应条件苛刻，涉及高温、高压、强酸催化剂(如h2so4、hno3)和有毒氧化剂(如臭氧、过氧化氢)。该工艺始终存在着低产率、高能耗、副产物不可控等问题，对环境危害严重，不符合现代的“绿色和可持续发展”理念。生物合成具有条件温和、对环境友好、区域立体选择性和对映体选择性高的优点，有望替代化学合成成为工业生产二元羧酸的新工艺。

2、2013年song报道了以油酸为原料的酶法级联工艺来生产癸二酸(附图2)，具体过程是：(1)油酸的不饱和碳-碳双键被水合酶羟基化；(2)nad+依赖的仲醇脱氢酶(adh)催化羟基脱氢还原为羰基；(3)nadph依赖的单加氧酶(bvmo)经过baeyer-villiger氧化反应生成“正常”构型酯(1-壬酸-9-羟基壬酯)和“异常”构型酯(1,10-癸二酸-1-辛酯)；(4)1,10-癸二酸-1-辛酯水解得到癸二酸。(song,j.w.；jeon,e.y.；song,d.h.；jang,h.y.；bornscheuer,u.t.；oh,d.k.；park,j.b.multistep enzymatic synthesis of long-chainα,ω-dicarboxylic andω-hydroxycarboxylic acids from renewable fatty acidsand plant oils.angewandte chemie inter-national edition,2013,52(9),2534-2537.)。据报道，目前倾向于将氧原子转移到较少取代的碳中心，以生成1,10-癸二酸-1-辛酯的天然单加氧酶仅源自铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pabvmo)和荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens dsm 50106，pfbvmo)。

3、该多酶级联催化合成癸二酸体系中，两种氧化还原酶的辅因子特异性不同，adh需要nad+并将其转化为nadh，而bvmo需要nadph并将其转化为nadp+，nadph与酶促过程中的电子传递和氧气激活有关，bvmo的氧化速率受到nadph的限制。因此，实现nadph再生能大大提高bvmo的催化效率，同时降低体外级联反应的成本。

4、过量添加辅因子会使生产成本大幅增加。目前常用的方法是额外添加辅因子再生系统。例如，对于adh催化过程的nad+再生，通常添加nadh氧化酶(nox)，利用氧气将nadh重新氧化为nad+；对于bvmo催化过程的nadph再生，通常添加6-葡萄糖脱氢酶(gdh)催化葡萄糖生成葡萄糖酸的同时将nadp+还原为nadph。然而，在统一的反应条件下对于其中一个酶可能不是最优的，需要对多个酶的速率进行匹配优化以实现级联反应的最大催化效率，若不断增加酶数量和底物，会增加多酶匹配的复杂性，同时产生的副产物增加了癸二酸的提纯难度。因此构建基于级联反应的辅因子原位循环再生系统具有重要意义。

5、该癸二酸合成体系中基于级联反应的nadp+/nadph原位循环再生系统，即adh酶促反应和bvmo酶促反应相耦合，在体外加入少量的nadp+，adh突变体在催化底物的同时将nadp+转化成bvmo所需的nadph，bvmo能够利用adh的催化产物并将nadph氧化为nadp+，从而形成辅因子再生的闭合循环。

6、通过蛋白质工程改变辅因子特异性为辅因子循环原位再生体系的构建提供了一种新思路。例如，seo等人通过仲醇脱氢酶(micrococcus luteus)的辅因子特异性转换，成功将工程酶(adh_d37s/a38r/v39s/t15i)偶联到nadph依赖型bvmo上(pseudomonas putidakt2440)，实现从蓖麻油酸到羟基壬酸体系中辅因子再生。(seo,e.j.；kim,h.j.；kim,m.j.；kim,j.s.；park j.b.cofactor specificity engineering of a long-chain secondaryalcohol de-hydrogenase from micrococcus luteus for redox-neutralbiotransformation of fatty acids.chemical communications,2019,55(96),14462-14465.)tishkov等人通过理性设计由天然nad+依赖的甲醇脱氢酶(pseudomonas sp.101，fdh)筛选得到了nadp+特异性甲醇脱氢酶，并与醇脱氢酶和单加氧酶结合，分别合成r-醇和手性内酯。(tishkov,v.i.；galkin,a.g.；fedorchuk,v.v.pilot scale production andisolation of recombinant nad+-and nadp+-specific formatedehydrogenases.biotechnology and bioengineering,1999,64(2):187-193.)bommareddy等人成功将来自谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的辅因子特异性从nad+改变为nadp+，提高了糖酵解途径中赖氨酸的产量。(bommareddy,r.r.；chen,z.；rappert,s.；zeng,a.p.a de novo nadph generationpathway for improving lysine production of corynebacterium glutamicum byrational design of the coenzyme specificity of glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase.metabolic engineering,2014,25,30-37.)beier等人通过计算设计将不动杆菌(acinetobactersp.ncimb 9871)中环己酮单加氧酶的辅因子偏好性从nadph切换到nadh。(beier,a.；bordewick,s.；genz,m.；schmidt,s.；van den bergh,t.；peters,c.；joosten,h.j.；bornscheuer,u.t.switch in co-factor specificity of a baeyer–villiger monooxygenase.chembiochem,2016,17(24),2312-2315.)

7、本发明开发的基于仲醇脱氢酶定向进化的辅因子原位循环再生系统，有助于简化多酶共催化合成癸二酸体系中的产物分离和多酶间匹配性优化，提高体系的催化效率，降低生产成本。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有的多酶共催化合成癸二酸体系中两种氧化还原酶辅因子特异性不匹配的问题，开发了一种基于仲醇脱氢酶定向进化的nadph原位再生系统的构建方法(附图1)，将adh辅因子偏好性由nad+转变为nadp+，实现1分子10-羟基硬脂酸和1分子nadp+经adh催化后生成1分子10-羰基硬脂酸和1分子nadph，同时bvmo能催化1分子10-羰基硬脂酸和1分子nadph生成1分子1,10-癸二酸-1-辛酯并氧化回1分子nadp+，实现体系内单辅因子催化和nadp+/nadph再生自循环。

2、一种基于仲醇脱氢酶定向进化的癸二酸多酶催化合成体系中nadph原位再生系统的构建方法，包括如下步骤：

3、s1、仲醇脱氢酶(adh)定向进化，得到辅因子偏好性由nad+转变为nadp+的突变体adh_d37g和adh_d37g/a38t/v39k；

4、s2、构建基于级联反应的nadph原位再生系统，催化转化得到癸二酸前体。

5、在本发明实施方式中，突变体adh_d37g将仲醇脱氢酶的第37位天冬氨酸替换为甘氨酸，突变体adh_d37g/a38t/v39k在adh_d37g的基础上将第38位丙氨酸替换为苏氨酸，第39位缬氨酸替换为赖氨酸。对两种突变体进行酶学性质表征，与野生型adh相比，验证对nadp+的利用效率。

6、在本发明实施方式中，酶促反应开始后立即持续监测340nm处吸光度，用于表征nadph的生成量，计算动力学参数。

7、在本发明实施方式中，所用仲醇脱氢酶突变体adh_d37g与原始酶相比具有更大的辅因子结合口袋，消除了潜在的静电斥力，减少了空间位阻，更有利于nadp+的结合；而adh_d37g/a38t/v39k在adh_d37g的基础上提供了更多肽链与nadp+磷酸基团之间的氢键，更好地逆转了仲醇脱氢酶的辅因子特异性(附图3)。

8、在本发明实施方式中，所用baeyer-villiger单加氧酶源自铜绿假单胞菌(pabvmo)，对于生成“异常”构型的酯有较好的选择性。

9、在本发明实施方式中，仲醇脱氢酶表达载体使用pet-22b(+)质粒，单加氧酶表达载体使用pet-28a(+)质粒，工程菌的宿主细胞为感受态大肠杆菌细胞e.coli bl21(de3)。

10、在本发明实施方式中，反应体系中底物10-羟基硬脂酸浓度为0.5～2.5mm。

11、在本发明实施方式中，反应体系中催化剂adh浓度为0.1～1.0mg/ml，bvmo浓度为0.1～1.0mg/ml。

12、在本发明实施方式中，反应体系在ph为7.4～8.0的pbs缓冲液或tris-hcl缓冲液中进行，酶促反应的温度为25℃，反应时间为24h。

13、在本发明实施方式中，反应体系中加入10～30g/l吐温20用于促进水相和有机相的溶合。

14、在本发明实施方式中，反应体系中加入0.2～1.0mm nadp+作为辅因子来源，用于验证nadph原位再生系统。

15、在本发明实施方式中，气相色谱检测采用db-1色谱柱。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、本发明使天然nad+依赖的仲醇脱氢酶的辅因子偏好性转变为nadp+，在adh与bvmo之间建立了一个nadp+/nadph自循环系统。级联反应无需再添加额外的辅因子再生系统，仅添加少量nadp+即可实现从10-羟基硬脂酸到癸二酸的转化，且比原始的多酶催化有更高的癸二酸产率。克服了目前化学生产中能耗高、副产物不可控的缺陷，以及目前文献报道的多酶催化合成体系中辅因子无法再生、能量供应不足等问题。本发明有助于简化产物分离和多酶间匹配性优化，从而降低酶促转化过程的成本。该发明对于其他相关生物转化过程的辅因子再生系统的设计具有借鉴意义。