一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法

1.本发明涉及乳酸菌发酵技术领域，具体是一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法。


背景技术：

2.乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性细菌，能够发酵糖类产生乳酸，是改善人体肠道菌群和人类身体健康的益生菌，广泛应用于食品、人和动物保健、饲料等领域，近年来乳酸菌还应用于l-乳酸的工业发酵生产。多数乳酸菌是厌氧型或兼性厌氧型，与好氧微生物相比较，其抗氧胁迫机制不健全，培养环境中以及菌株生长代谢过程产生的活性氧对菌株有毒害作用。一般的乳酸菌发酵都会采用通入氮气等无氧条件下培养，以提高活菌比率。有氧条件下培养的乳酸菌的菌体活性比在无氧条件下的低，但有氧条件下乳酸菌菌体密度比在无氧培养条件下的高。活性氧族，包括超氧阴离子自由基、羟自由基等活性氧族自由基和过氧化氢、臭氧等非自由基类的氧衍生物都能对乳酸菌细胞造成损伤。在乳酸菌生长过程中除了氧胁迫，乳酸菌代谢分泌的乳酸等有机酸产物会对乳酸菌产生酸胁迫，大量积累的乳酸会抑制乳酸菌的生长，导致乳酸菌在高密度发酵中后期细胞活性下降。另外，酸胁迫作用还会影响菌株细胞内羟自由基的产生，进而对氧胁迫起到增强作用。因此要严格控制培养条件以实现乳酸菌的大规模高活性细胞培养。
3.例如中国专利，公告号为：cn 113234656 a，该发明公开了一种发酵乳酸菌的高密度发酵工艺，属于乳酸菌培养技术领域，取活化后的乳杆菌属放置在高密度发酵培养池中，所述高密度发酵培养池按重量份数计，低聚糖20～30份、王枣子提取物10～15份、牛肉粉6～15份、酵母粉5～10份、大豆分离蛋白10～15份。
4.该发明没有有效的方法降低培养环境中活性氧的毒害作用，降低了菌体发酵密度和细胞活性，发酵不稳定，乳酸发酵强度低，工艺复杂，不利于后续的乳酸纯化工序，不适合工业放大生产。所以本发明提出一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法，以解决上述提出的问题。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法，以解决现有的技术手段没有有效的方法降低培养环境中活性氧的毒害作用，降低了菌体发酵密度和细胞活性，发酵不稳定，乳酸发酵强度低的问题。
6.为了达到上述目的，本发明的基础方案如下：一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法，包括如下步骤：
7.步骤一，选用兼性厌氧型乳酸菌为生产菌株，将选取的乳酸菌分为若干不同批次接种至培养基中进行活化培养，培养温度为37℃；
8.步骤二，采取通气的方式进行有氧培养，耦联活性氧抑制剂和膜分离技术进行分批补料发酵；
9.步骤三，在每批次乳酸菌达到对数生长期间的8-30小时内，进行如下操作：发酵10小时后进行2次补料，流加葡萄糖和酵母膏用以补充发酵前期的营养物质消耗继续促进菌体的生长，残糖浓度降至40-60g/l时补加葡萄糖，第一次补加至终浓度为160g/l，第二次补加至终浓度为200g/l；发酵24小时后启动蠕动泵，将发酵液泵入膜过滤装置，发酵液中乳酸等小分子物质渗透过膜微孔经代谢物排出口流出，用以后续乳酸的生产，而滞留在膜内的大分子物质经循环出口导出，经进料口导入发酵罐中继续参与下一批次发酵反应；
10.步骤四，膜过滤发酵2-3批次，每批次膜过滤后再经补料继续发酵；
11.步骤五，发酵结束后发酵液和发酵过程的滤过液用以乳酸的生产。
12.进一步，步骤一中选用的兼性厌氧型乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌中的一种或多种。
13.进一步，步骤一中采用的活性氧抑制剂为nac，nac工作浓度为0.6-1.2％。
14.进一步，步骤一中采用的培养基为菌种培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌。
15.进一步，步骤二中采用的培养基为发酵培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖120g、玉米浆30g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌。
16.进一步，步骤二中的有氧条件为，培养过程中通入空气供菌体生长，空气通入量为0.5vvm-2.5vvm。
17.进一步，步骤三中采用的超滤膜为聚醚砜中空纤维膜，截留分子量为10 000-100 000道尔顿。
18.基础方案的原理：本发明提出的有氧高密度发酵生产乳酸的方法抑制发酵培养过程中活性氧的产生及减轻其毒害作用，降低发酵培养过程中代谢产物乳酸的反馈抑制作用和酸胁迫作用，显著提高乳酸发酵的菌体密度和菌体活性，从而提高乳酸产量。
19.所达到的有益效果是：本发明提出的有氧高密度发酵生产乳酸的方法从降低活性氧毒害作用和代谢产物乳酸的反馈抑制、酸胁迫作用两方面入手，建立了一种乳酸菌有氧高密度培养与膜分离技术分批补料发酵生产乳酸的方法，提高菌体密度和细胞活性，降低代谢产物反馈抑制作用。本方法整合了活性氧抑制剂和膜分离技术，降低培养环境中活性氧的毒害作用，以及解除代谢产物乳酸的反馈抑制作用和酸胁迫对氧胁迫的促进作用，提高了菌体发酵密度和细胞活性，延长了发酵稳定期，增强了乳酸发酵强度，乳酸产量达到183.1g/l，糖酸转化率达到91.6％。本方法添加的活性氧抑制剂其成分和用量明确，有利于生产过程的标准化控制和质量控制。本方法采用膜分离技术分离乳酸，工艺简单，有利于后续的乳酸纯化工序，适合工业放大生产。
20.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
21.图1为本发明实施例的方法流程图。
22.图2是本技术实施例的鼠李糖乳杆菌有氧培养和膜分离培养生长曲线图。
23.图3是本技术实施例的鼠李糖乳杆菌耦合膜分离有氧补料培养生长曲线图。
具体实施方式
24.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
25.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“竖向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
26.在本发明的描述中，除非另有规定和限定，需要说明的是，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
27.下面通过具体实施方式进一步详细说明。
28.实施例1：
29.实施例基本如附图1、附图2和附图3所示：一种乳酸菌有氧高密度发酵生产乳酸的方法，包括如下步骤：
30.步骤一，选用兼性厌氧型乳酸菌为生产菌株，将选取的乳酸菌分为若干不同批次接种至培养基中进行活化培养，培养温度为37℃；选用的兼性厌氧型乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌中的一种或多种；采用的培养基为菌种培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌；
31.步骤二，采取通气的方式进行有氧培养，耦联活性氧抑制剂和膜分离技术进行分批补料发酵；有氧条件为，培养过程中通入空气供菌体生长，空气通入量为0.5vvm-2.5vvm；采用的活性氧抑制剂为nac，nac工作浓度为0.6-1.2％；采用的培养基为发酵培养基，包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖120g、玉米浆30g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌。
32.步骤三，在每批次乳酸菌达到对数生长期间的8-30小时内，进行如下操作：发酵10小时后进行1-2次补料，流加葡萄糖和酵母膏用以补充发酵前期的营养物质消耗继续促进菌体的生长，残糖浓度降至40-60g/l时补加葡萄糖，补加至葡萄糖终浓度为120g/l；发酵24小时后启动蠕动泵，将发酵液泵入膜过滤装置，发酵液中乳酸等小分子物质渗透过膜微孔经代谢物排出口流出，用以后续乳酸的生产，而滞留在膜内的大分子物质经循环出口导出，经进料口导入发酵罐中继续参与下一批次发酵反应。采用的超滤膜为聚醚砜中空纤维膜，截留分子量为10 000-100 000道尔顿；
33.步骤四，膜过滤发酵2-3批次，每批次膜过滤后再经补料继续发酵；
34.步骤五，发酵结束后发酵液和发酵过程的滤过液用以乳酸的生产。
35.具体实施过程如下：将乳酸菌培养方案分为5组。
36.第一组：采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株静置培养(厌氧培养)
37.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中静置培养20小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中发酵培养，培养过程中自动流加体积分数8％-10％的氨水调节ph值至6.3-6.5，36小时后结束发酵。
38.第二组:采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株有氧培养
39.培养条件：发酵培养过程中需通入一定量的空气供菌体生长，通入量为0.5-2.5vvm，生物反应器搅拌转速为70-100r/m。
40.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中振荡培养18小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中进行有氧发酵培养，培养过程中自动流加体积分数8％-10％的氨水调节ph值至6.3-6.5，36小时后结束发酵。
41.第三组:采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株添加氧抑制剂有氧培养
42.培养条件：发酵培养基添加活性氧抑制剂，发酵培养过程中需通入一定量的空气供菌体生长，通入量为0.5-2.5vvm，生物反应器搅拌转速为70-100r/m。
43.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中振荡培养18小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中进行有氧高密度发酵培养，自动流加体积分数8％-10％的氨水调节ph值至6.3-6.5，36小时后结束发酵。
44.第四组:采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株添加氧抑制剂有氧分批补料培养
45.活性氧抑制剂：采用nac为活性氧抑制剂，nac工作终浓度为0.8％。
46.培养条件：发酵培养基添加活性氧抑制剂，发酵培养过程中需通入一定量的空气供菌体生长，通入量为0.5-2.5vvm，生物反应器搅拌转速为70-100r/m。
47.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中振荡培养18小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中进行有氧高密度发酵培养，发酵过程中，自动流加体积分数8％-10％的氨水调节ph值至6.3-6.5，葡萄糖浓度低于50g/l时补加葡萄糖，使发酵培养基中葡萄糖浓度为120g/l，补料后继续发酵，36小时后结束发酵。
48.第五组:采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株有氧膜过滤分批补料培养
49.超滤膜：采用的超滤膜为聚醚砜中空纤维膜，截留分子量为10 000-100 000道尔顿。
50.培养条件：发酵培养过程中需通入一定量的空气供菌体生长，通入量为0.5-2.5vvm，生物反应器搅拌转速为70-100r/m。
51.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中振荡培养18小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中进行有氧高密度发酵培养；发酵培养12小时后，进行膜过滤和补料，操作如下：启动蠕动泵，将发酵液泵入膜过滤装置，发酵液中乳酸等小分子物
质渗透过膜微孔经代谢物排出口流出，而截留在膜内的大分子物质经循环出口导出，经进料口导入发酵罐中，补入新鲜培养基至原发酵体积，使罐内葡萄糖终浓度为120g/l，继续发酵反应，第36小时结束发酵。
52.结果如附图2所示，有氧培养条件下的乳酸发酵，乳酸菌的生长在0-6小时为延滞期，6-12小时为对数生长前期，12-16小时为对数生长后期，由于有氧发酵培养过程中活性氧、乳酸代谢物的产生和不断积累会对乳杆菌造成损伤，以及培养基中葡萄糖等营养物质的消耗，乳酸菌菌体生长速率下降，16-20小时为稳定期，稳定期时间较短，最大活菌数为6.31
×
109cfu/ml，之后进入衰减期，24小时后，乳酸菌活菌数量低于厌氧培养。在有氧发酵基础上采取添加氧抑制剂、补料、膜过滤等的培养策略，乳酸菌在对数生长期后能够延长稳定期时间，增加有效活菌数，最大活菌数达到1.43
×
10
10
cfu/ml，由此可见添加氧抑制剂和分离乳酸代谢产物对乳酸菌起到显著的保护作用。
53.实施例2：
54.与上述实施例不同之处在于，如附图3所示：采用鼠李糖乳杆菌为生产菌株添加氧抑制剂有氧膜过滤补料培养
55.菌种培养基：包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌。
56.发酵培养基：包括蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖120g、玉米浆30g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、吐温80 1ml和1l蒸馏水，其中ph6.3-6.5，115℃，15min灭菌。
57.活性氧抑制剂：采用nac为活性氧抑制剂，nac工作终浓度为0.8％。
58.超滤膜：采用的超滤膜为聚醚砜中空纤维膜，截留分子量为10 000-100 000道尔顿。
59.培养条件：发酵培养基添加活性氧抑制剂，工作浓度为0.8％，发酵培养过程中需通入一定量的空气供菌体生长，通入量为0.5-2.5vvm，生物反应器搅拌转速为70-100r/m。
60.操作步骤：取保藏菌种接种到固体菌种培养基中培养16-20小时，活化菌种；取活化菌种转接至液体菌种培养基中振荡培养18小时，制备发酵菌种；按5％接种量转接发酵菌种至生物反应器液体发酵培养基中进行有氧高密度发酵培养；发酵培养10小时后，进行2次补料，残糖浓度降至40-60g/l时补加葡萄糖，第一次补加至终浓度为160g/l，第二次补加至终浓度为200g/l，继续发酵反应；发酵培养24小时后，进行膜过滤和补料，操作如下：启动蠕动泵，将发酵液泵入膜过滤装置，发酵液中乳酸等小分子物质渗透过膜微孔经代谢物排出口流出，而截留在膜内的大分子物质经循环出口导出，经进料口导入发酵罐中，补入新鲜培养基至原发酵体积，罐内葡萄糖浓度为180g/l，继续发酵反应；发酵38小时后再次进行膜过滤和补料操作，罐内葡萄糖浓度为200g/l继续发酵反应；发酵48小时后结束发酵，收获全部发酵液，与前两次膜过滤滤出液一起用于后续乳酸的生产。
61.实施例2结果如附图3所示，在添加氧抑制剂有氧发酵培养条件下，乳酸菌的培养在10-24小时为分批补料培养阶段，流加的葡萄糖和酵母膏用以补充发酵前期的营养物质消耗继续促进菌体的生长，发酵18-24小时后代谢产物乳酸的累积抑制菌体生长，此时进行过滤培养并补充新鲜的培养基，以解除乳酸抑制，促进菌体继续生长。24-38小时为第一次
过滤培养，38-48小时为第二次过滤培养。由于采取氧抑制剂的添加和关键节点的补料、乳酸过滤等发酵过程控制，降低了有氧发酵培养过程中活性氧、乳酸代谢物对乳杆菌造成的损伤，促进了乳酸菌菌体生长，最大活菌数为2.46
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10
10
cfu/ml，24-48小时为稳定期，延长了菌体生长的稳定期。在有氧发酵基础上耦合氧抑制剂、补料、膜过滤的培养策略，乳酸菌在对数生长期后能够延长稳定期时间，增加有效活菌数，增强菌体乳酸生产强度，乳酸产量达到183.1g/l，糖酸转化率达到91.6％。由此可见添加氧抑制剂nac和膜分离乳酸代谢产物对乳酸菌起到显著的保护作用，促进有氧发酵条件下乳酸整体产量。
62.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。