一种基于CTDNA表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法与流程

一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法
技术领域
1.本发明属于基于肝癌的早期筛查/早期干预检查的技术领域，更具体地说，涉及一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法。


背景技术：

2.早期肝癌的检查手段通常为b超检查，包括黑白超声和彩色超声检查，而彩色超声对早期肝癌的检查较有价值，可发现肝脏肿瘤的大小、位置、血供情况以及和周围器官相关性、有无局部受侵等情况。当然，如果肿瘤较小，如1cm及以下的肿瘤，则b超检查可能并不能显示较清楚，这时可通过核磁共振检查，包括核磁共振增强，如普美显造影等，还有增强ct检查，可更加明确肝脏占位病变的性质、大小、数目以及和周围组织、器官的关系。
3.除此之外，可对肿瘤标记物，包括afp(甲胎蛋白)等进行密切监测，因此b超对肝癌的早期发现可起到初筛作用，而后续可通过ct、核磁共振进一步明确。对有乙肝病史的患者，一定要监测患者乙肝dna的复制情况，并给予积极的抗病毒治疗，另外还要进行定期体检，及早发现早期肝癌的发生。
4.现有的肝癌分子分型中，现有的肝癌分子分型是基于蛋白表达，如免疫组化法，多是依据人工，其主观性在判读的过程中容易影响判读结果，另外，蛋白表达无法绝对定量，在新型肝癌风险评估中，目前肝癌复发风险是基于rt-pcr方法计算，在计算过程中存在着起始rna需要量多、操作复杂、时间周期长、不能同时进行分子分型检测的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法，包括如下步骤：
8.s1、采集受试者的肝癌精准分子样本；
9.s2、准备检测或测量受试样品dna中sept9基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针，测定上述肝癌精准分子样本中基因数据的表达分子分型集率；
10.s3、将汽化的受试样品分子在高真空的离子源内转化为带电离子，经电离、引出和聚焦后进入质量分析器，在磁场或电场作用下，按时间先后或空间位置进行质荷比(质量和电荷的比，m/z)分离，最后被离子检测器检测，给出化合物的分子量、分子式及结构信息；
11.s4、通过上述样本中基因数据的分子量、分子式及结构信息，确定所述受试者的多维度肝癌精准分子分型和/或生存的风险。
12.其中，用于检测所述sept9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物sae in no:1-2和探针saq in no:3、特异性引物sem id no:4-5和探针sem id no:6、特异性引物seq id no:7-8和探针seq id no:9。
13.其中，所述基于dna表达的基因呈多态性位点设置，所述多态性位点是通过与基因性疾病有关基因位点，挑选了n+1个位点，表中以位点a、位点b、位点n+1表示；基因型是这些位点在人群中出现的m+1种亚型，表中以亚型a、亚型b、亚型m+1代替；参考频率是根据亚型在中国人群中各自所占的比例；风险度是根据不同基因型对于所述多基因疾病的相对风险度。
14.其中，对基于ct dna表达的多维度肝癌精准分子基因的表达量进行定量分析，通过设定的阈值来对标本进行分子分型，具体的分型方法步骤如下：
15.①
、采用vrpsolver软件对肝癌精准分子基因的表达量进行定量分析；
16.②
、采用机器学习方法对多维度肝癌精准分子具有临床明确分型结果样本的alexa fluor染料、fitc、texas red、cy3、cy5基因的表达量进行分型模型训练，基于模型对标本进行二代测序(ngs)的亚型预测；
17.③
、对于预测出er+和her2+阳性的病人，进一步进行二级分类；其中er+阳性的病人可进一步分为luminal a型和luminal b型，her2+阳性的病人进一步分为her2型和luminal b-her2型。
18.其中，所述样本中基因数据诊断物可以为蛋白质微阵列、elisa诊断试剂盒、免疫组化(ihc)试剂盒、二代测序试剂盒、实时荧光定量pcr试剂盒、基因芯片或其组合；
19.所述样本中基因数据诊断物为基于靶向测序的二代测序试剂盒或实时荧光定量pcr试剂盒；
20.所述样本中基因数据诊断物为基于靶向rna-seq的二代测序试剂盒，其包含总rna抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂中的一种或多种，以及核苷酸序列如表4所示的引物；
21.所述二代测序试剂为可供构建靶向rna-seq的文库illumina定制的试剂。
22.其中，计算未校准的风险值，用gt标识，所述gt标识风险值计算如下：
23.gt＝0if rsu＜0；rs＝20
×
(rsu-6.7)if 0≤rsu≤100；rs＝100if rsu＞100，按照公式gt＝gt
×
100/max(gt)，确保gt取值控制在1-99之间；根据数据采集计量年限大于5年的样本的最大gt值作为cut-off值，小于cut-off值就是低风险人群。
24.其中，所述肝癌精准分子样本中基因数据检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，其中，gth、gtl为风险基因型，携带分子分型的风险基因型时对基因分子加重了机体自由基损伤。
25.其中，所述风险评估方法还包括多维度肝癌精准分子分型风险评估系统，所述多维度肝癌精准分子分型风险评估系统包括诊断模块，所述诊断模块利用所述样本中基因数据的分子量、分子式及结构信息作出判断，所述系统还可以包括数据输入模块、数据预处理模块、模型训练模块、模型测试模块。
26.其中，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离dna提取试剂和血浆游离dna甲基化转化试剂，所述血浆游离dna甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐，所述受试样品dna为完整基因组、无细胞dna或循环肿瘤dna。
27.本发明的技术效果和优点：
28.本发明提供的一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法，采集受试者的肝癌精准分子样本，会得到相关的指标因素，利用特异性引物和探针测定上述肝癌精准分子样本中基因数据的表达分子分型集率，按时间先后或空间位置进行质荷比
(质量和电荷的比，m/z)分离，最后被离子检测器检测，给出化合物的分子量、分子式及结构信息，实现全面准确的分析，能够找到与肝癌最相关的指标，确定所述受试者的多维度肝癌精准分子分型和/或生存的风险，实现绝对定量的蛋白表达，能够找到与肝癌最相关的指标，缩减起始rna需要量、简化操作、周期短，可同时进行分子分型检测。
附图说明
29.图1为本发明的基于ct dna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法流程图。
具体实施方式
30.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
31.在本发明的描述中，需要理解的是，指示方位或位置关系的术语为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
32.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据说明书具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
33.本发明提供了如图1的一种基于ctdna表达的多维度肝癌精准分子分型风险评估方法，包括如下步骤：
34.s1、采集受试者的肝癌精准分子样本；
35.s2、准备检测或测量受试样品dna中sept9基因甲基化状态或水平的特异性引物和探针，测定上述肝癌精准分子样本中基因数据的表达分子分型集率；
36.s3、将汽化的受试样品分子在高真空的离子源内转化为带电离子，经电离、引出和聚焦后进入质量分析器，在磁场或电场作用下，按时间先后或空间位置进行质荷比(质量和电荷的比，m/z)分离，最后被离子检测器检测，给出化合物的分子量、分子式及结构信息；
37.s4、通过上述样本中基因数据的分子量、分子式及结构信息，确定所述受试者的多维度肝癌精准分子分型和/或生存的风险。
38.具体的，用于检测所述sept9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物sae in no:1-2和探针saq in no:3、特异性引物sem id no:4-5和探针sem id no:6、特异性引物seq id no:7-8和探针seq id no:
9。
39.具体的，所述基于dna表达的基因呈多态性位点设置，所述多态性位点是通过与基因性疾病有关基因位点，挑选了n+1个位点，表中以位点a、位点b、位点n+1表示；基因型是这些位点在人群中出现的m+1种亚型，表中以亚型a、亚型b、亚型m+1代替；参考频率是根据亚型在中国人群中各自所占的比例；风险度是根据不同基因型对于所述多基因疾病的相对风险度。
40.具体的，对基于ct dna表达的多维度肝癌精准分子基因的表达量进行定量分析，通过设定的阈值来对标本进行分子分型，具体的分型方法步骤如下：
41.①
、采用vrpsolver软件对肝癌精准分子基因的表达量进行定量分析；
42.②
、采用机器学习方法对多维度肝癌精准分子具有临床明确分型结果样本的alexa fluor染料、fitc、texas red、cy3、cy5基因的表达量进行分型模型训练，基于模型对标本进行二代测序(ngs)的亚型预测；
43.③
、对于预测出er+和her2+阳性的病人，进一步进行二级分类；其中er+阳性的病人可进一步分为luminal a型和luminal b型，her2+阳性的病人进一步分为her2型和luminal b-her2型。
44.具体的，所述样本中基因数据诊断物可以为蛋白质微阵列、elisa诊断试剂盒、免疫组化(ihc)试剂盒、二代测序试剂盒、实时荧光定量pcr试剂盒、基因芯片或其组合；
45.所述样本中基因数据诊断物为基于靶向测序的二代测序试剂盒或实时荧光定量pcr试剂盒；
46.所述样本中基因数据诊断物为基于靶向rna-seq的二代测序试剂盒，其包含总rna抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂中的一种或多种，以及核苷酸序列如表4所示的引物；
47.所述二代测序试剂为可供构建靶向rna-seq的文库illumina定制的试剂。
48.具体的，计算未校准的风险值，用gt标识，所述gt标识风险值计算如下：
49.gt＝0if rsu＜0；rs＝20
×
(rsu-6.7)if 0≤rsu≤100；rs＝100if rsu＞100，按照公式gt＝gt
×
100/max(gt)，确保gt取值控制在1-99之间；根据数据采集计量年限大于5年的样本的最大gt值作为cut-off值，小于cut-off值就是低风险人群。
50.具体的，所述肝癌精准分子样本中基因数据检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，其中，gth、gtl为风险基因型，携带分子分型的风险基因型时对基因分子加重了机体自由基损伤。
51.具体的，所述风险评估方法还包括多维度肝癌精准分子分型风险评估系统，所述多维度肝癌精准分子分型风险评估系统包括诊断模块，所述诊断模块利用所述样本中基因数据的分子量、分子式及结构信息作出判断，所述系统还可以包括数据输入模块、数据预处理模块、模型训练模块、模型测试模块。
52.具体的，所述试剂盒中还包含下述组成部分：血浆游离dna提取试剂和血浆游离dna甲基化转化试剂，所述血浆游离dna甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐，所述受试样品dna为完整基因组、无细胞dna或循环肿瘤dna。
53.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
54.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。