一种樟芝菌丝体的发酵方法和樟芝发酵辅助组合物

1.本发明属于生物工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种樟芝菌丝体的发酵方法和樟芝发酵辅助组合物。


背景技术：

2.樟芝(antrodia camphorata)，别名牛樟芝、红樟芝、牛樟菇等，属多孔菌科、薄孔菌属，在自然环境中仅寄生于牛樟树上。樟芝在刚被发现时曾被误认为是灵芝的一种，长期以来被民间用于治疗酒精中毒、腹痛腹泻等疑难杂症，事实上樟芝中三萜的种类及含量远超灵芝，是名副其实的药材之王。
3.研究表明，樟芝的药效来自它所含的多糖、三萜、黄酮、苯环类、泛醌衍生物、琥珀酸衍生物等成分，其中三萜类化合物是樟芝的核心药理成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、免疫调节等功能。樟芝子实体中分离得到的多种三萜化合物能够通过细胞毒作用、抑制肿瘤细胞转移等机制等达到抗肿瘤效果；樟芝甲醇粗提物中的三萜化合物表现出显著的抗炎抗氧化活性，能够诱导内源性抗氧化基因表达以及限制活性氧的过度产生来保护肝脏细胞免受氧化应激；樟芝三萜化合物提取物能有效改善胰岛素抵抗，增加肝脏的胰岛素敏感性，对糖尿病和高脂血具有良好的治疗潜力；部分三萜化合物可促进t细胞的增殖与分化，增强免疫反应。因此，樟芝三萜化合物具有极高的研究价值及广阔的应用前景。
4.国内外樟芝三萜化合物的药理研究日趋升温，但其产量的低下严重阻碍了樟芝三萜化合物的深入研究与广泛应用。樟芝生长的缓慢性及寄主的专一性导致了野生樟芝资源的极度匮乏，难以满足市场需求。由此，樟芝的人工培养技术应运而生。目前樟芝的人工培养技术主要分为固体栽培法和液体发酵法，前者得到的是樟芝子实体，所产三萜化合物产量较高，但培养周期长，生产成本高，难以实现大规模商业化生产；后者得到的是主要是樟芝菌丝体，培养周期短，生产成本低，易于进行质量控制，是目前主要的樟芝人工培养方式，但所得发酵产物樟芝菌丝体中三萜化合物的含量较低。因此通过各种方法提高液体发酵中樟芝三萜的产量已成为本领域关注和研究的热点。
5.专利公开号为cn104212726a(一种牛樟菌的液体发酵培养基)的专利公开了另一种提高樟芝发酵产生三萜化合物的方法，但其利用大量的沉水樟木屑为原料，一方面由于沉水樟木为名贵木材价格较贵，另一方面沉水樟木生长缓慢，难以达到稳定的产量或实现产业化；专利公开号为cn104126412a的专利，公开了一种添加萜品醇(松油醇)促进樟芝液态发酵菌丝生长及高产萜类化合物的方法，公开了在樟芝发酵过程中添加单一的前体物质来促进樟芝菌丝生长以及萜类化合物积累的方法，该方法在发酵时间为12天，使樟芝生物量提高6％以及三萜化合物产量提高36％，但其三萜化合物产量仍不高，培养周期较长。因此，如何在现有的前体物质的基础上，开发一种更适合规模化、持续生产的樟芝液体发酵培养基的方法，实现有效提高樟芝发酵中三萜化合物的产量，对于樟芝发酵及其上下游产业均具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种樟芝菌丝体的发酵方法，该方法相比现有技术可在较短发酵时间内，使樟芝液体发酵后得到的樟芝菌丝体中，三萜化合物的产量更高。
7.本发明的又一目的是提供上述方法制备得到的樟芝发酵菌丝体；本发明的再一目的是提供上述樟芝发酵菌丝体在作为提取三萜化合物的原料中的应用。
8.本发明的再一目的是提供一种樟芝发酵辅助组合物，该组合物可用于樟芝菌丝体发酵得到三萜化合物的产量更高的樟芝菌丝体。
9.本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：
10.一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
11.s1.对樟芝菌株进行液体发酵60-120h；
12.s2.向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，继续发酵120h以上，得到所述樟芝菌丝体；
13.所述前体物质为辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇，并使得添加前体物质后的发酵液中辅酶q0的含量为100-500mg/l、对羟基苯甲酸的含量为20-300mg/l、芳樟醇的含量为0.1-0.5mg/l、α-松油醇的含量为0.3-0.7mg/l。
14.本发明通过实验发现在樟芝液体发酵60-120h后，将前体物质辅酶q0 100-500mg/l、对羟基苯甲酸20-300mg/l、芳樟醇0.1-0.5mg/l和α-松油醇0.3-0.7mg/l一起加入到樟芝液体发酵液中继续发酵120h后，前体物质可以在樟芝菌丝体发酵中相互配伍、有利于樟芝次级代谢合成萜类化合物，大大促进樟芝菌丝体发酵中三萜化合物的合成和积累。因此，该特定前体物质可作为促樟芝发酵产生三萜化合物的激发子，应用于提高樟芝菌丝体发酵生产三萜化合物产量。
15.进一步地，步骤s2中所述向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，其添加的时机为在步骤s1中樟芝液体发酵72h后加入。
16.进一步地，步骤s2中所述添加前体物质后的发酵液中辅酶q0的含量为300mg/l、对羟基苯甲酸的含量为100mg/l、芳樟醇的含量为0.3mg/l、α-松油醇的含量为0.5mg/l。
17.本发明中，可以采用任何已知的樟芝菌株作为原料，现有的樟芝菌株生理生化性质接近。作为一种具体例子，本发明中，采用保藏号为atcc no.200183的樟芝(antrodia camphorata)菌株。
18.进一步地，步骤s2中所述向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，其加入方法为先分别将辅酶q0溶解在溶剂dmso中，将对羟基苯甲酸、芳樟醇、α-松油醇溶解在溶剂乙醇中；然后再添加到樟芝液体发酵液中。
19.本发明中将辅酶q0和对羟基苯甲酸、芳樟醇、α-松油醇分别用溶剂进行溶解，可以利于在添加到樟芝液体发酵液时，前体物质充分在发酵液里扩散。
20.进一步地，步骤s1中樟芝液体发酵其利用樟芝种子液按15-25％(v/v)的接种量转接入基础发酵培养基形成樟芝液体发酵液，进行摇瓶发酵培养。
21.进一步地，所述基础发酵培养基其组成为：葡萄糖15-25g/l，酵母粉0.5-3g/l，七水硫酸镁1-5g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，ph值为4-5。
22.进一步地，所述樟芝种子液的制备方法为：将保藏号为atcc no.200183的樟芝菌株接种在pda斜面培养基中培养20-30天；培养完成后取斜面培养基的斜面上的菌块，移至
种子培养基中，于25～28℃，100～150rpm，振荡培养12～15天，形成樟芝种子液。
23.更进一步地，所述种子培养基其组成为：葡萄糖15-25g/l，酵母粉0.5-3g/l，七水硫酸镁1-5g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，ph值为4-5。
24.进一步地，步骤s2中所述继续发酵其发酵时间为120h。
25.本发明提供了上述方法制备得到的樟芝发酵菌丝体。
26.本发明提供了上述樟芝发酵菌丝体在作为提取三萜化合物的原料中的应用。
27.本发明还提供了一种樟芝发酵辅助组合物，所述辅助组合物包含以下重量份数的组分：100-500份辅酶q0、20-300份对羟基苯甲酸、0.1-0.5份芳樟醇和0.3-0.7份α-松油醇。
28.进一步地，所述辅助组合物包含以下重量份数的组分：300份辅酶q0、100份对羟基苯甲酸、0.3份芳樟醇和0.5份α-松油醇。
29.本发明还提供了上述樟芝发酵辅助组合物在作为樟芝发酵添加剂中的应用。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
31.本发明提供的樟芝菌丝体的发酵方法通过将前体物质在特定的时机加进樟芝液体发酵液中，使发酵液中前体物质辅酶q0含量为100-500mg/l、对羟基苯甲酸含量为20-300mg/l、芳樟醇含量为0.1-0.5mg/l和α-松油醇含量为0.3-0.7mg/l使得前体物质间发生有效配伍，有利于樟芝次级代谢合成三萜化合物，提高樟芝发酵生产三萜化合物产量(三萜化合物产量较对照组最高可提高74％)，且相比现有技术缩短了发酵周期(可缩短发酵周期为192h)、操作简易。本发明提供的方法使用的前体物质和前体物质组合物，是可工业化生产的原料，容易获得，生产成本低，可应用于提高樟芝发酵生产三萜化合物产量；本发明方法是一种更适合规模化、可持续生产的樟芝液体发酵培养基的方法。
附图说明
32.图1为樟芝液态发酵过滤后的菌丝体和摇瓶液体发酵状态图。
33.图中标注：a表示对比例11样品；b表示对比例1样品；c表示对比例5样品；d表示实施例6样品；e表示实施例1样品；f表示实施例2样品。
具体实施方式
34.本发明中提到的“前体物质”的含义为：加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中利用构成产物分子结构的一部分，而其本身结构没有大的变化，但产物的产量可以获得较大提高的一类化合物。本发明中提到的“激发子”的含义为：多糖、多肽、糖蛋白、小分子等能够快速、专一并可选择性地激发生物某些特定基因表达，能够影响生物次生代谢途径或调控生物合成目的产物的一些物质。本发明中提到的“辅助组合物”，是指在樟芝发酵中添加入的组合物，该组合物可以辅助樟芝的发酵的进程，影响其发酵产物。
35.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
36.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
37.实施例1
38.一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
39.s1.以保藏号为atcc no.200183的樟芝(antrodia camphorata)菌株为发酵出发菌株，先进行樟芝液体发酵，实际上，由于樟芝菌株生理生化性质相近，其他樟芝的也可以作为发酵出发菌株。樟芝液体发酵其利用樟芝种子液按20％(v/v)的接种量转接入装有100ml基础发酵培养基的500ml摇瓶中，形成樟芝液体发酵液，在转速120rpm，26℃条件下进行摇瓶发酵72h。
40.其中，上述基础发酵培养基其组成为：葡萄糖20g/l，酵母粉2g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾3g/l，ph值为4-5，根据实际需要，基础发酵培养基的组成在如下范围葡萄糖15-25g/l，酵母粉0.5-3g/l，七水硫酸镁1-5g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，ph值为4-5，均可有较好的培养效果。
41.上述樟芝种子液的制备方法为：将樟芝菌株接种在pda斜面培养基中培养25天，培养温度为26℃，根据实际需要pda斜面培养在20-30天，培养温度在25-28℃均可；培养完成后取斜面培养基的斜面上的菌块，切取1
×
1cm2的菌块，转接至种子培养基中，具体为转接装有100ml液体种子培养基的500ml摇瓶中，于26℃，120rpm，振荡培养14天，形成樟芝种子液，根据需要在震荡培养的条件在25-28℃，100～150rpm，培养12-15天，均可以形成樟芝种子液，达到樟芝菌株活化的目的；种子培养基其组成为：葡萄糖20g/l，酵母粉1g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾3g/l，ph值为4.5，根据实际需要，种子培养基的组成在如下范围葡萄糖15-25g/l，酵母粉0.5-3g/l，七水硫酸镁1-5g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，ph值为4-5，均可有较好的培养效果；pda培养基为通用的pda培养基，本实施例使用的pda培养基组成为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，ph自然。
42.s2.向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，前体物质为辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇；分别将前体物质辅酶q0溶解在溶剂dmso中，将对羟基苯甲酸、芳樟醇、α-松油醇溶解在溶剂乙醇中；然后再添加到樟芝液体发酵液中，并使得添加前体物质后的发酵液中辅酶q0的含量为：辅酶q0 100mg/l、对羟基苯甲酸20mg/l、芳樟醇0.1mg/l和α-松油醇0.3mg/l。继续发酵120h，每组做3个重复(平行样品)，得到的发酵液记录为实施例1样品。
43.实施例2
44.一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
45.步骤s1部分同实施例1，区别部分为步骤s2添加前体物质的量不同，具如下：向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，前体物质为辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇；使得添加前体物质后的发酵液中辅酶q0的含量为：辅酶q0 300mg/l、对羟基苯甲酸100mg/l、芳樟醇0.3mg/l和α-松油醇0.5mg/l。继续发酵120h，每组做3个重复(平行样品)，得到的发酵液记录为实施例2样品。
46.实施例3
47.一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
48.步骤s1部分同实施例1，区别部分为步骤s2添加前体物质的量不同，具如下：向发酵得到的樟芝菌株液体发酵液中添加前体物质，前体物质为辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇；使得添加前体物质后的发酵液中辅酶q0的含量为：辅酶q0 500mg/l、对羟基苯甲酸300mg/l、芳樟醇0.5mg/l和α-松油醇0.7mg/l。继续发酵120h，每组做3个重复(平行样品)，得到的发酵液记录为实施例3样品。
49.对比例1-11
50.一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
51.步骤s1部分同实施例1，区别部分为步骤s2添加前体物质的种类或添加前体物质后发酵液中前体物质的量，具体如表1所示，在表1中对比例1所表达的含义为：添加的前体物质只有辅酶q0，添加辅酶q0后其在发酵液中的量为300mg/l，其他对比例的前体物质种类和添加后在发酵液中前体物质的量具体见表1，依据上述方法发酵得到的发酵液分别记录为对比例1-11样品。
52.表1对比例1-11添加前体物质的种类和添加量
[0053][0054][0055]
实施例4-6
[0056]
一种樟芝菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
[0057]
步骤s1部分同实施例2，区别部分为步骤s2添加前体物质的时机不同，如实施例4为在樟芝液体发酵60h后，添加和实施例2相同的前体物质发酵培养得到的发酵液，其他实施例详见表2，得到的发酵液分别记录为实施例4-实施例6样品。
[0058]
表2实施例4-6和对比例12-14添加前体物质的时机
[0059]
编号添加前体物质时机实施例460h实施例596h实施例6120h对比例1224h对比例1348h对比例14150h
[0060]
对比例12-14
[0061]
一种添加前体的樟芝发酵的方法，包括如下步骤：
[0062]
步骤s1部分同实施例1，区别部分为步骤s2添加前体物质的时机不同，详见表2，得到的发酵液分别记录为对比例12-对比例14样品。
[0063]
实施例7
[0064]
一种樟芝发酵辅助组合物，所述辅助组合物包含以下重量份数的组分：100份辅酶q0、20份对羟基苯甲酸、0.1份芳樟醇和0.3份α-松油醇。
[0065]
使用时，将上述重量比的组合物添加到樟芝液体发酵液中，使樟芝液体发酵液中辅酶的含量为q0 100mg/l、对羟基苯甲酸的含量为20mg/l、芳樟醇的含量为0.1mg/l和α-松油醇的含量为0.3mg/l。
[0066]
实施例8
[0067]
一种樟芝发酵辅助组合物，所述辅助组合物包含以下重量份数的组分：300份辅酶q0、100份对羟基苯甲酸、0.3份芳樟醇和0.5份α-松油醇。
[0068]
使用时，将上述重量比的组合物添加到樟芝液体发酵液中，使樟芝液体发酵液中辅酶的含量为q0 300mg/l、对羟基苯甲酸的含量为100mg/l、芳樟醇的含量为0.3mg/l和α-松油醇的含量为0.5mg/l。
[0069]
实施例9
[0070]
一种樟芝发酵辅助组合物，所述辅助组合物包含以下重量份数的组分：500份辅酶q0、300份对羟基苯甲酸、0.5份芳樟醇和0.7份α-松油醇。
[0071]
使用时，将上述重量比的组合物添加到樟芝液体发酵液中，使樟芝液体发酵液中辅酶的含量为q0 500mg/l、对羟基苯甲酸的含量为300mg/l、芳樟醇的含量为0.5mg/l和α-松油醇的含量为0.7mg/l。
[0072]
实验例1
[0073]
1.实验方法
[0074]
将上述液体发酵培养完成后所得的实施例1-6和对比例1-14样品等体积(100ml)发酵液先用8层纱布过滤，然后用去离子水冲洗3次后真空冷冻干燥，得到干燥的樟芝菌丝体后，称量干燥的樟芝菌丝体的重量，利用干燥的樟芝菌丝体的重量和各样品体积来计算生物量(mg/l)，并计算各平行样品的生物量平均值。
[0075]
2.实验结果
[0076]
图1为对比例1、对比例5、对比例11、实施例1、实施例2、实施例6样品樟芝液态发酵过滤后的菌丝体和摇瓶液体发酵状态图，从图1可以看出不同样品的樟芝菌丝体和发酵液颜色发生了变化，实施例样品较对比例样品颜色较深，说明前体物质的加入，改变了樟芝发酵的进程。
[0077]
各实施例1-6和对比例1-14样品的生物量平均值测定结果如表3所示，从实施例和对比例樟芝菌丝体生物量可以看出，在发酵60h后添加四种前体物质辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇的一种、三种、四种不会引起樟芝菌丝体生物量的较大变化，反而在添加时机小于60h(对比例12-13)，会影响樟芝的生长，导致樟芝菌丝体生物量处于较小水平。
[0078]
表3实施例1-6和对比例1-14樟芝菌丝体生物量
[0079][0080]
实验例2
[0081]
1.实验方法
[0082]
利用下述方法，测定实施例1-6和对比例1-14样品中三萜化合物的产量，具体方法如下：
[0083]
三萜产量的检测：将上述液体发酵培养所得的实施例1-6和对比例1-14样品用8层纱布过滤，去离子水冲洗3次后真空冷冻干燥，得到干燥的樟芝菌丝体；准确称取50mg干燥的樟芝菌丝体，加1ml甲醇提取24h，提取完成后，12000rpm离心1min，收集上清液即为样品提取液；取100μl样品提取液于具塞磨口试管，沸水浴挥干水分；挥干水分后，在具塞磨口试管中加入300μl现配的5％香草醛-冰醋酸溶液和1ml高氯酸，60℃水浴20min；水浴完成后，将盛放样品的具塞磨口试管置于冰水混合物中冷却，冷却后加10ml冰醋酸混匀，在550nm波长下测定吸光度。以熊果酸为对照品，绘制三萜化合物标准曲线，根据标准曲线计算三萜化合物含量，并计算各平行样品的三萜化合物含量平均值。
[0084]
2.实验结果
[0085]
实施例1-6和对比例1-14样品的三萜化合物含量平均值如表4所示，从表4可以看出，四种前体物质辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇的添加量并非越高越好，而是相互之间有影响的(对比例9-10)，其对樟芝发酵产三萜化合物并不是简单的线性叠加，如果配比不合理，会导致添加四种前体物质的樟芝液体发酵三萜化合物的产量和一种或三种前体物质的相近甚至低于其产量。实施例1-6相比对比例11(不添加任何前体物质，三萜化合物的产量为60.7mg/l)、对比例1-4(仅添加一种前体物质，三萜化合物的产量为64.9-70.5mg/l)、对比例5-8(缺失一种前体物质，三萜化合物的产量为70.3-78.0mg/l)和对比例9-10(四种前体物质中前体物质过高或过低，三萜化合物产量为69.9-70.6mg/l)三萜化合
物的产量均显著提高(85.9-105.8mg/l)，可见本特定前体物质辅酶q0、对羟基苯甲酸、芳樟醇和α-松油醇大大促进樟芝发酵中三萜化合物的合成，提高了樟芝发酵生产三萜化合物产量，相对于未添加前体物质的樟芝液体发酵，提升了42％-74％(实施例1-5)。
[0086]
同时，根据表4中实施例2、实施例4-6和对比例12-14的三萜化合物产量结果可以发现，在樟芝液体发酵中，添加前体物质的时机对三萜化合物的合成也具有较大的影响。过早添加前体物质会对菌体生长造成严重的抑制作用，而在发酵后60-120h添加以上前体物质能有效地促进三萜化合物的产生。因此，本发明四种特定添加量的前体物质辅酶q0 100-500mg/l、对羟基苯甲酸20-300mg/l、芳樟醇0.1-0.5mg/l和α-松油醇0.3-0.7mg/l在前体物质添加时机为60-120h条件下，樟芝液体发酵三萜化合物产量最高。
[0087]
表4测定实施例1-12和对比例1-9三萜化合物含量
[0088][0089][0090]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。