一株副干酪乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株副干酪乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤衰老也称为皮肤老化，是皮肤组织在内外环境的不断作用下细胞结构功能发生退化，出现皮肤质地改变、色素改变、血管萎缩或增生的生理现象。皮肤衰老通常分为内源性老化(自然衰老)和外源性老化(光老化)。老化导致炎症发生，活性氧增加，氧化应激增加，细胞修复能力下降，同时细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分随着皮肤衰老而显着减少。在衰老机制的研究中发现，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老。寻求针对不同皮肤老化途径并且提升皮肤细胞状态的抗衰老物质是目前重要的研究方向。
3.人体的皮肤表面由细菌、真菌、病毒等各种微生物，与皮肤组织、细胞以及各种分泌物、微环境等共同组成了一个微观的生态系统，即皮肤微生态。正常情况下，皮肤表面各种微生物、宿主以及外环境三者互相作用，构成了微生态平衡，可以一定程度上抵御外界对皮肤的伤害，保持皮肤健康。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。皮肤共生菌可通过调节抗菌肽的生成，从而调控皮肤受损后的炎症反应及参与局部免疫防御。皮肤正常共生菌可以通过直接分泌或诱导机体自身生成抗菌肽，抑制病原微生物的繁殖。它常见的作用方式是通过增加细菌细胞膜的通透性，裂解细菌，造成细菌的死亡。
4.因此，提供一种利用微生物技术开发的皮肤微生态相关产品，在改善皮肤状态方面具有广大的应用价值。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的是提供了一株副干酪乳杆菌及其应用。
6.本发明的其一目的是提供了副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)，该菌株被命名为gforu-31，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:m 20221354的副干酪乳杆菌。
7.较佳地，采样于健康女童粪便，将样品处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清液划线于mrs固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为gforu-31；
8.在革兰氏染色镜检下菌株gforu-31革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
9.本发明的另一目的是提供了上述副干酪乳杆菌在制备改善肌肤状况的产品中的应用，其中，所述改善肌肤状况包括促进细胞增殖、抗衰老、提升皮肤抗菌能力中的至少一种，所述促进细胞增殖是指促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞增殖。
10.一些实施方案中，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因由col13a1、ln、fn中的至少一种组成。
11.一些实施方案中，所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达、上调细胞自噬相关基因lc3b的表达、上调细胞抗氧化相关基因sirt-1和/或nrf2的表达、上调免疫调节因子相关基因mor的表达中的其中一种表达。
12.一些实施方案中，所述抗衰老为抗衰老为抑制胶原蛋白酶活性。
13.一些实施方案中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因由p38mapk、mmp家族中的至少一种组成。
14.一些实施方案中，所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因由bax、caspase-9中的至少一种组成。
15.一些实施方案中，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因s100a7和/或s100a8的表达。
16.本发明的再一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，所述产品为食品、药品或化妆品，由包括上述副干酪乳杆菌原料制成，所述产品中的副干酪乳杆菌包括如下所示的至少一种：
17.(1)副干酪乳杆菌的活菌和/或灭活菌；
18.(2)副干酪乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。
19.本发明公开的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gforu-31，其保藏编号为cctcc no:m 20221354的副干酪乳杆菌。实验表明，gforu-31具有促进细胞增殖、抗衰老、提升皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
20.生物保藏说明
21.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gforu-31，于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221354。
具体实施方式
22.本发明提供了副干酪乳杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
23.本发明的副干酪乳杆菌菌株gforu-31，来源于3岁健康女孩粪便，经16srdna鉴定为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
24.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gforu-31，于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221354。
25.进一步，本发明提供的副干酪乳杆菌gforu-31在本发明所述的应用或产品中,存
在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液、灭活菌体。
26.体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有促进表皮细胞hacat修复的作用，gforu-31提升sds损伤的hacat细胞存活率，提升存活率111.54％-119.13％。
27.体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有上调hacat细胞外基质相关的类胶原膜蛋白13α链基因col13a1，细胞自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3β基因lc3b以及抗氧化相关基因核因子e2相关因子2基因nrf2表达的作用，基因相对表达倍数1.20～2.67；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶p38mapk表达的作用，基因相对表达倍数0.24～0.84。
28.体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有促进人成纤维细胞hff增殖的作用，增殖率123.43％～125.58％。
29.体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有上调hff细胞外基质相关的层粘连蛋白ln、纤维连接蛋白fn，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，抗氧化相关基因sirtuins蛋白家族基因sirt-1，以及抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2表达的作用，基因相对表达倍数1.15～2.74；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp，细胞凋亡相关的bcl2-associated x蛋白基因bax和半胱氨酸蛋白酶家族基因caspase-9，基因相对表达倍数0.31～0.89。
30.体外实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有抑制胶原蛋白酶活性的作用，抑制率24.95％～28.71％。
31.体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌gforu-31具有上调抗菌肽相关基因s100a7和s100a8表达的作用，基因相对表达倍数1.54～2.91。
32.本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
33.实施例1：gforu-31的分离
34.采样于3岁健康女孩粪便中采样；将样品处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清液划线于mrs固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为gforu-31。
35.革兰氏染色镜检：菌株gforu-31为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
36.实施例2：gforu-31的核酸鉴定
37.1、16s rdna基因序列分析：
38.挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，12000r/min转速离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f,1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
39.2、结果
40.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得
出gforu-31菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。
41.实施例3：gforu-31促进sds诱导的人永生化角质形成细胞hacat损伤修复实验
42.1、gforu-31灭活菌体制备：
43.挑取副干酪乳杆菌gforu-31单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16h～18h，121℃，30min高压灭活，12000r/min转速离心2min，离心沉淀以适量pbs重悬，稀释调整od
600
＝0.2，为灭活菌体。
44.2、促进hacat细胞修复实验
45.接种hacat细胞(5
×
104cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/ml sds，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔添加10％灭活菌体(对照组以等体积pbs替代灭活菌体)培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度a。
46.细胞存活率计算公式及结果如下表：
[0047][0048]
上表结果可知，gforu-31灭活菌体对hacat细胞sds损伤具有修复作用。
[0049]
实施例4：gforu-31调节光老化hacat细胞外基质/抗氧化/细胞自噬/炎症因子相关基因表达实验
[0050]
1、gforu-31上清液及灭活菌体制备：
[0051]
挑取副干酪乳杆菌gforu-31单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
＝0.2，121℃，30min、0.28mpa灭活，12000r/min转速离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量pbs重悬，稀释调整od
600
＝0.2，为灭活菌体。
[0052]
2、hacat细胞制备及紫外线损伤
[0053]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
[0054]
3、gforu-31添加
[0055]
将上清液5％(v/v)、灭活菌体10％(v/v)分别加入刺激过的hacat细胞(对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0056]
4、qpcr法检测细胞外基质/抗氧化/细胞自噬相关基因相对表达倍数
[0057]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col13a，抗氧化相关基因nrf2，细胞自噬相关基因lc3b，降解细胞外基质相关基因mmp1和p38mapk的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0058]
公式：f＝2-δδct
，其中：
[0059]
△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
[0060]
△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
[0061]
△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
[0062]
上清液下调降解细胞外基质相关基因mmp1和p38mapk。结果见下表：
[0063][0064]
灭活菌体上调细胞外基质基因col13a；上调抗氧化基因nrf2；上调细胞自噬基因lc3b。结果见下表：
[0065][0066]
结果显示加入gforu-31具有促进hacat细胞外基质合成、增加抗氧化、促进细胞自噬和减少细胞外基质的抗衰老作用。
[0067]
实施例5：gforu-31促进人成纤维细胞hff的增殖
[0068]
1、gforu-31灭活菌体制备：
[0069]
制备方法参照实施例3。
[0070]
2、hff细胞制备及gforu-31添加
[0071]
接种以dmem培养的hff细胞，以100ul/孔(每孔含3
×
104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μm h2o2，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，pbs清洗两次，加入100μl新培养基，各孔添加灭活菌体10％(v/v)，(对照组以等体积pbs替代灭活菌体)。培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度a。
[0072]
计算公式及结果如下表：
[0073][0074]
结果显示添加gforu-31具有促进hff细胞增殖的作用。
[0075]
实施例6：gforu-31调节氧化损伤hff细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因表达实验
[0076]
1、gforu-31上清液及灭活菌体制备：
[0077]
制备方法参照实施例4。
[0078]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0079]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0080]
3、gforu-31添加
[0081]
将上清液5％(v/v)、灭活菌体10％(v/v)分别加入刺激过的hff细胞(对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0082]
4、qpcr法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因相对表达倍数
[0083]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因ln和fn，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2；以及降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax和caspase-9的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0084]
上清液上调抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax和caspase-9，结果见下表：
[0085][0086]
灭活菌体上调细胞外基质相关基因fn和ln，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor，抑制凋亡基因相关基因bcl-2；下调降解细胞外基质相关基因mmp3。结果见下表：
[0087]
[0088][0089]
结果显示加入gforu-31具有促进hff细胞外基质合成、增加抗氧化、增加细胞免疫调节因子、减少细胞凋亡、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。
[0090]
实施例7：gforu-31抑制胶原蛋白酶活性实验
[0091]
1、gforu-31上清液的制备：
[0092]
制备方法参照实施例4。
[0093]
2、胶原蛋白酶活性抑制率检测
[0094]
用不同浓度的甘氨酸标准溶液绘制标准曲线，将50μl 0.2％的明胶溶液和50μl 0.1mol/l ph7.5 tris-hcl(含50mmol/l cacl2)溶液混合，加入上清液25μl(对照组以等体积mrs替代上清液)，在37℃反应0.5h。终止反应后在593nm下测定胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。
[0095]
胶原蛋白活性抑制率计算公式及结果见下表：
[0096][0097]
结果显示gforu-31上清液抑制胶原蛋白酶活性的抗衰老作用。
[0098]
实施例8：gforu-31上调hacat抗菌肽相关基因表达实验
[0099]
1、gforu-31上清液的制备：
[0100]
制备方法参照实施例4。
[0101]
2、hacat细胞制备
[0102]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0103]
3、gforu-31添加及lps刺激
[0104]
将上清液5％(v/v)加入培养过夜的hacat细胞中(对照组以等体积pbs替代)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
[0105]
4、qpcr法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
[0106]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测s100a7和s100a8基因的表达。以等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0107]
结果见下表：
[0108][0109]
结果显示gforu-31上清液具有促进细胞抗菌肽相关基因表达的作用。
[0110]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。