一株根内根孢囊霉及其在湿地中强化磷吸收的应用的制作方法

1.本发明属于污水处理技术领域，尤其涉及一株根内根孢囊霉及其应用。


背景技术：

2.人工湿地技术应用始于20世纪70年代初。该技术是模拟天然湿地，由人工建造和控制运行的一种污水净化处理技术，主要通过人工介质、植物、微生物等的物理、化学、生物三重协同作用，实现对污水的高效净化。人工湿地去除的污染物主要包括有机氮、氨氮、磷、有机物、悬浮物和病原菌等。随着我国对人工湿地技术研究及应用的不断加深，该技术已应用于污水处理、雨水面源污染防治、水体生态修复以及污水处理厂尾水提标等众多领域。人工湿地作为一种生态型污水处理技术，与传统污水处理方式相比，具有一次性投资小、运行费用低、耗能少以及易于管理维护、美化环境等特点，在污水处理中有着良好的应用前景。近年来，人工湿地技术逐渐完善，2016年北京市质量技术监督局发布《农村生活污水人工湿地处理工程技术规范》(db11/t1376-2016)，该规范详细介绍了人工湿地的工艺形式、工艺流程等。
3.丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae，am)真菌是自然界土壤中的普遍存在的一类有益微生物，约占土壤微生物总量的5-36％，是生物量最大的一类土壤真菌，它能够与80％以上的陆生植物形成良好的互利共生体也称为菌根(mycorrhizae)。丛枝菌根真菌可以促进并提高植物养分的吸收与利用效率，特别是植物磷养分的吸收利用方面。通过接种菌根真菌，其根外菌丝的生长可以增加植物根系和土壤的接触范围，即扩大根际范围，增加吸收表面积，提高土壤磷空间有效性，改善根际环境，从紧实的土壤中吸收磷养分，此外菌根真菌侵染增加了根系吸收能力。因此，人工湿地接种am真菌可以促进湿地植物对污水中磷的吸收，从而强化湿地的净化作用，那么研究并筛选丛枝菌根真菌中高效吸收养分并能促进湿地植物生长的菌种，对于人工湿地污水处理发展方面有着很重要的意义。


技术实现要素：

4.为提高人工湿地系统对污水磷的净化效果。本发明提供一株根内根孢囊霉及其应用。本发明提供的根内根孢囊霉可以显著增强植物对磷的吸收能力、促进植物生长、提高人工湿地系统对污水中磷的处理效果。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
6.本发明提供一株根内根孢囊霉，属于丛枝菌根真菌，该菌株名称为根内根孢囊霉xbd-006(rhizophagus intraradices xbd-006)，保藏编号为cgmccno.40250。已于2022年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
7.本发明提供的上述根内根孢囊霉可以在增强植物对磷的吸收、促进植物生长以及人工湿地系统处理污水中进行应用。由于在人工湿地实际应用中广泛采用挺水植物，包括芦苇等，因此，以种植在人工湿地中的芦苇为例，经过试验验证，接种本发明的根内根孢囊
霉后，芦苇的地上部干重显著高于不接种根内根孢囊霉的处理组，接种本发明的根内根孢囊霉后，植株吸磷量显著高于不接种根内根孢囊霉的处理组；与不接种根内根孢囊霉的处理组相比，接种本发明提供的根内根孢囊霉后，人工湿地系统对污水中磷的处理的效果可以显著提高。
8.本发明还提供一种菌剂，包括上述根内根孢囊霉。菌剂中除了上述的根内根孢囊霉还可以包括其他物质，比如用于培养根内根孢囊霉的培养基质、植物等。
9.本发明提供的菌剂具有显著增强植物对磷的吸收能力，促进植物生长，人工湿地系统对污水中磷的处理的效果。
10.本发明提供上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述根内根孢囊霉与植物、培养基质共同培养后收集培养物。所述植物可以为高粱，所述培养基质可以为沸石河沙混合基质。
11.本发明提供的上述根内根孢囊霉和/或上述菌剂可以在增强植物对磷的吸收、促进植物生长、污水处理及人工湿地中进行应用。例如，用于强化对磷的吸收。
12.以芦苇为例，接种本发明提供的菌剂后地上部干重显著高于不接种菌剂的处理组，接种本发明提供的菌剂后植株吸磷量显著高于不接种菌剂的处理组；与不接种根内根孢囊霉的处理组相比，接种本发明提供的菌剂后，人工湿地系统对污水中磷的净化效果显著提高。
13.本发明提供一种人工湿地，包括上述根内根孢囊霉和/或上述菌剂。
14.本发明提供一种强化磷吸收的方法，包括以下步骤：采用上述根内根孢囊霉或上述菌剂对磷进行吸收。采用本发明提供的根内根孢囊霉或菌剂可以显著提高植物对磷吸收效果。
15.上述方法可以应用于人工湿地中，相比未采用上述菌剂的方法，本发明提供的净化处理方法，可以使人工湿地系统对磷的净化效果显著提高。
附图说明
16.图1为根内根孢囊霉xbd-006的菌株形态图。
17.图2为丛枝菌根真菌侵染芦苇根段的结果，左图为丛枝菌根真菌侵染芦苇的根内菌丝和丛枝，右图为丛枝菌根真菌侵染芦苇的根外菌丝。
具体实施方式
18.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
19.本发明提供一株丛枝菌根真菌菌株，该菌株于2019年6月从北京市平谷区西柏店村北污水处理站采集芦苇根际填料偶然分离得到，经鉴定该菌株为根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices)，属于丛枝菌根真菌，将其编号为xbd-006，并于2022年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏编号为cgmccno.40250。
20.经过人工湿地接种试验结果表明，该菌株及采用该菌株制成的菌剂可以显著增强
植物对磷的吸收能力、促进植物生长、提高人工湿地对污水中的磷的净化效果。
21.本发明中，若未经特殊说明，本发明涉及的试剂、实验材料等均为本领域的常规试剂、实验材料，可以通过市购获得或采用本领域常规方法配制。若未经特殊说明，本发明采用的实验方法均为本领域的常规实验方法。
22.下面通过具体实施例进行介绍。
23.实施例1
24.丛枝菌根真菌菌株根内根孢囊霉xbd-006(rhizophagus intraradices xbd-006)的分离与鉴定。
25.(1)分离菌株
26.2019年6月，从北京市平谷区西柏店村北污水处理站采集芦苇根际填料，并从采集的填料中分离菌株，分离方法包括以下步骤：称取100克芦苇根际填料，放入大烧杯中加1000ml水，搅拌，静置10秒后过三层分样筛(上筛20目、中筛60目、下筛300目)，用水收集300目筛子上的残留物于培养皿中，在体式显微镜下随机挑取丛枝菌根真菌的单个孢子，接种于混合物，河沙与沸石的粒径均为1-2mm，河沙与沸石等体积混合，并种植高梁，培养3个月后，收获内含有菌株孢子、被侵染根段及根外菌丝的沸石沙混合物。上述中的河沙与沸石均可以从商业途经获得。
27.(2)菌株鉴定
28.称取20克步骤(1)收获的沸石沙混合物，放入大烧杯中，加1000ml水，搅拌，静置10秒后过三双层分样筛(上筛20目、中筛60目、下筛300目)，用水收集300目筛子上的残留物于培养皿中，在体式显微镜下挑取菌株的孢子，置于载玻片上，在生物显微镜下观察孢子形态。
29.根据《manual for the identification of va mycorrhizal fungi》与phylogeny and taxonomy of glomeromycota(http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/)和invam(http://invam.wvu.edu/)网站中的描述，鉴定该丛枝菌根真菌为根内根孢囊霉。将其命名为：根内根孢囊霉xbd-006(rhizophagus intraradices xbd-006)(简称ri)。
30.菌株形态如图1所示，参照关于微生物菌种命名的规范c.walker&schuessler(2010)、glomus intraradices n.c.schenck&g.s.sm.(1982)，对菌株ri的描述如下：孢子单生或成簇生长于土壤中，球形或近球形，直径70-150um，浅黄色至黄棕色。孢子壁三层(l1、l2、l3)：l1，无色，易逝壁，厚1-2um，随孢子成熟而逐渐消解，与melzer's试剂反应呈浅红色至深红色；l2，无色，通常紧贴于l1，厚1-2.5um，与l1类似，在成熟孢子中易消解，与melzer's试剂中不反应；l3，层状壁，浅黄色至黄色，厚3-5m，与melzer's试剂不反应。连点：宽9-15um,孔宽通常3.4-8.1um，近连点处连孢菌丝壁多层，与孢壁相连，孢壁在进入连点时形成火焰状喇叭形。
31.实施例2
32.以热河芦苇为供试植物，以菌株根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为xbd-006)、摩西斗管囊霉(funneliformis mosseae编号为bgc xj02))、根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为heb07d)作为供试菌种进行人工湿地接种试验。
33.根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为xbd-006)为本发明从北京市平
谷区西柏店村北污水处理站芦苇根际填料中分离获得，具体分离方法参照实施例1；摩西斗管囊霉(funneliformis mosseae编号为bgc xj02)和根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为heb07d)均由北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所丛枝菌根真菌种质资源库(bank of glomeromycota in china，bgc)提供，仅用于非商业目的重复本发明实施例的内容。以上供试菌种依次简称为ri、fm、rih。
34.2.1实验方法
35.该试验于2021年4月至2021年8月在北京市平谷区大兴庄村污水处理场站进行。利用人工湿地系统对污水净化处理，并比较接种含有ri的菌剂、含有rih的菌剂、含有fm的菌剂和不接种菌剂四种方式下人工湿地对污水中磷的净化处理效果。
36.供试人工湿地基本状况：地块35000mm*10200mm*1000mm，填料自下而上依次为高渗透固磷填料层、低渗透混合填料层，供试人工湿地种植有芦苇。上述填料层可以统称基质，可以作为填充材料，具有利于人工湿地植物与微生物生长、对污染物起过滤、吸收作用，其成分可以包括碎石、土壤、砂子等，上述材料可以通过市购获得。供试人工湿地的数量为四块，其中三块供试人工湿地分别用于接种含有ri的菌剂、含有rih的菌剂、含有fm的菌剂，另一块供试湿地不接种菌剂，菌剂的接种量为每平方米接种300g菌剂。除了接种菌剂情况不同外，供试人工湿地的其他情况均一致。
37.试验所用的上述菌种的菌剂用沸石河沙混合基质培养高粱扩繁获得，接种剂为含有真菌孢子、菌丝、侵染根段等繁殖体的混合基质，菌剂的制备方法可以参照文献：王幼珊，张淑彬，张美庆，2012.中国丛枝菌根真菌资源与种质资源.北京：中国农业出版社。
38.试验设置4个处理组，分别为接种含有ri的菌剂(ri组)、rih的菌剂(rih组)、fm的菌剂(fm组)和对照组(ck)。ri组接种的菌剂为根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为xbd-006)菌剂，rih组接种的菌剂为根内根孢囊霉(rhizophagus intraradices编号为heb07d)菌剂，fm组接种的菌剂为摩西斗管囊霉(funneliformis mosseae编号为bgc xj02)菌剂，ck组未接种菌剂。
39.ri组：将上述制备的含有ri的菌剂接种到芦苇根际土壤中，接种比例为每平方米人工湿地接种300g菌剂。
40.rih组：将上述制备的含有rih的菌剂接种到芦苇根际土壤中，接种比例为每平方米人工湿地接种300g菌剂。
41.fm组：将上述制备的含有fm的菌剂接种到芦苇根际土壤中，接种比例为每平方米人工湿地接种300g菌剂。
42.ck组：对照组除了未接种菌剂外，其他均与以上三组相同。
43.接种菌剂后，待芦苇生长5个月，分别收集各组的植株地上部、地下部根系；并在芦苇根际土壤取20ml土壤样品，混合均匀后测定孢子密度(即20ml土壤样品含有的孢子数)。
44.将地下部根系用自来水和去离子水冲洗干净，取10根样剪成1cm根段，用于菌根侵染率测定。菌根侵染率测定方法包括以下步骤：将根段用墨水醋染色方法染色根段，选取30条根段制片，镜检进行菌根侵染率测定。墨水醋染色方法可以参照文献：horst v,andrew p c,urs w,et al.ink and vinegar,a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi.applied and environmental microbiology,1998,64(12)：5004-5007.根据菌根侵染分级标准分为6个分级，分别为：0、》0且≤1％、》1且≤10％、》10且≤
58.(3)丛枝菌根真菌对芦苇吸收磷的影响
59.不同菌剂对人工湿地芦苇吸磷量的实验结果如表3所示，从表3中可以看出，接种丛枝菌根真菌ri处理人工湿地芦苇的吸磷量显著高于rih组、fm组和ck组；接种丛枝菌根真菌ri后，菌根吸磷贡献率可以达到39.8％。说明，采用本发明提供的菌株可以显著提高吸磷量。
60.表3不同处理人工湿地芦苇吸磷量
[0061][0062]
(4)丛枝菌根真菌对人工湿地对磷的净化效果的影响
[0063]
对人工湿地磷的净化效果的影响的实验结果如表4所示，从表4可以看出，接种丛枝菌根真菌ri处理人工湿地对磷的净化效果要优于rih组、fm组和ck。接种丛枝菌根真菌ri处理的人工湿地对磷的净化效果比不接种和其他两个菌种分别提高31.6％、13.6.0％、8.7％。说明，采用本发明提供的菌株可以显著提高人工湿地对磷的净化效果。
[0064]
表4不同处理人工湿地对磷的净化效果
[0065][0066]
综上所述，本发明提供的根内根孢囊霉可以促进并提高作物养分的吸收与利用效率，特别是植物磷养分的吸收利用方面。通过接种本发明提供的菌根真菌，其根外菌丝的生长可以增加植物根系和土壤的接触范围，即扩大根际范围，增加吸收表面积，提高土壤磷空间有效性，改善根际环境，从紧实的土壤中吸收磷养分，此外菌根真菌侵染增加了根系吸收能力。通过在人工湿地接种本发明提供的根内根孢囊霉或根内根孢囊霉制成的菌剂可以促进湿地植物对污水中磷的吸收，从而强化湿地对污水中磷的净化作用，作为一种生物技术在处理污水的人工湿地中具有极大的应用潜力。
[0067]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。