Ii-Key/HPV16E7/MHC杂交肽及应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽及应用。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一种包膜双链环状dna病毒，通过感染人体鳞状上皮，引起细胞增生，宫颈癌的产生绝大多数与hpv的感染有关。根据致癌能力的强弱，分为高危型hpv(16、18、31、53、58等)及低危型hpv(6、11、55、66等)。hpv基因组可分为三个区域，早期蛋白编码区能够编码早期蛋白(e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7)、晚期蛋白编码区编码晚期蛋白(l1、l2)，以及上游调控区。e6和e7在调控细胞周期和凋亡中具有重要的作用，高危型hpv病毒进入人体导致e6和e7基因的高表达，使得细胞增殖异常，最终诱发宫颈癌变。

2、e6和e7通过靶向宿主细胞周期控制来驱动肿瘤的发生，导致hpv感染细胞的生长和肿瘤的生长不受控制，并且e6和e7的高水平表达，不会逃避免疫反应，因此大多数的治疗型疫苗都以e6和e7作为免疫治疗靶点。

3、目前的预防性疫苗包括gsk公司研发的hpv18、hpv18型二价疫苗、merck公司针对hpv6、11、16、18型四价疫苗和hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的九价hpv疫苗。

4、治疗型的hpv疫苗主要是通过激活细胞的免疫应答进一步清除病毒细胞。当前研发的较为普遍的有肽疫苗、蛋白质疫苗、活载体疫苗和细胞疫苗等。肽疫苗是通过筛选hpv的杀伤性t淋巴细胞抗原表位，优点是安全、稳定，但其通常只有弱免疫原性。载体疫苗是将目的基因重组至细菌或病毒的基因片段上，优点是免疫原性强，缺点是免疫过程中会导致疫苗的免疫效力下降。

5、中国专利cn201910959912.4公开了一种以il-33为佐剂的hpv纳米疫苗组合物及其制备方法，所述的组合物包括e7-plga纳米疫苗和il-33佐剂，且所述的hpv纳米疫苗组合物中最终含抗原e7的量与il-33的量比例为5:1-5:10。该专利利用il-33作为佐剂，安全性高、副作用更小，但其不能良好的诱导细胞进行免疫。

6、中国专利cn201710187380.8公开了一种加强型人乳头瘤病毒hpv-16/18的二价dc疫苗，包括经基因修饰的树突状细胞中的重组基因序列由粒细胞-巨噬细胞刺激因子、人乳头瘤病毒hpv-16与hpv-18的l1转录区串联，该dc疫苗由经基因修饰的dc表面抗原组成，包括增强抗原表达的粒细胞-巨噬细胞刺激因子、hpv-16和hpv-18的l1抗原蛋白，该发明属于防治结合型疫苗，能够有效预防hpv-16、hpv-18的感染和hpv感染引起的相关疾病。但dc疫苗的成本较高。

7、因此，有必要提供一种安全有效的方法来预防和/或治疗hpv阳性癌症。

技术实现思路

1、本发明的术语和声明：

2、1、如本文所用，冠词“一个”、“一种”和“所述”：除非以其它方式明确地限定到一个(种)对象，否则包括复数的对象。

3、2、如本文所用，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名法委员会(biochemicalnomenclaturecommission)所推荐的单字母符号来提及。

4、3、如本文所用，术语“蛋白质”：是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。该术语还包括蛋白质的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括指对天然蛋白质或多肽的氨基酸序列的修饰如缺失、替换、插入后所得的变体。

5、4、如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任意组合。表达的核酸分子通常操作性连接到表达控制序列(例如启动子)。

6、5、如本文所用，术语“核酸”是指dna(包括cdna、基因组dna和合成dna)或rna分子，它们可以是单链或双链的。若为单链，核酸可以是编码链或非编码链(反义链)。核酸是包含或组成为核苷酸单体的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸-骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸”还包括修饰的核酸，例如碱基修饰、糖修饰或主链修饰等的dna或rna分子。

7、6、如本文所用，术语“残基”是指在蛋白质的序列中，氨基酸之间的氨基和羧基脱水成键，而剩下的没有脱水成键的基团就叫残基。

8、7、如本文所述，术语“疫苗”指在药学上可接受的载体中(例如佐剂)包含抗原或免疫原性物质的组合物。

9、8、如本文所用，术语“佐剂”指添加至本文所描述的疫苗中的以增强抗原的免疫原性的任何分子、元素、物质。

10、本发明技术方案包括：

11、一方面，本发明提供了一种ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽，所述的ii-key/hpv16e7/mhc杂交肽包括：

12、(1)ii蛋白的lrmk残基；

13、(2)hpv16 e7的mhcⅱ类表位；

14、所述ii蛋白的lrmk残基的氨基酸序列如seq id no:1所示；

15、所述hpve7的mhc ii类表位的氨基酸序列如seq id no:2所示。

16、可选择的，所述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽包括：

17、(1)ii蛋白的lrmk残基；

18、(2)编码相同杂交肽的dna；

19、优选地，所述ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽还包括可选地中间化学结构；

20、进一步优选地，所述的中间化学结构共价连接hpv16 e7 mhcⅱ类表位的n末端和ii蛋白的lrmk残基的c末端元件。

21、在一些实施例中，上述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽可利用固相或液相化学合成技术获得，或通过重组dna技术合成。

22、在一些实施例中，所述ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽可通过修饰基团进行修饰。

23、在一些实施例中，所述修饰基团的类型包括功能性分子修饰和/或翻译后修饰。

24、在一些实施例中，所述功能性分子修饰选自亲和标签修饰、荧光基团修饰、聚乙二醇修饰、叠氮基团、炔烃基团修饰、非天然氨基酸中的至少一种。

25、在一些实施例中，所述翻译后修饰选自甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰、泛素化修饰中的至少一种。

26、另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码上述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽。

27、优选地，所述核酸，本领域的技术人员可以采用已知的方法获得，例如定向进化或点突变。

28、又一方面，本发明提供了一种疫苗。

29、所述的疫苗包含上述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽和/或上述的核酸。

30、优选地，所述疫苗为预防和/或治疗hpv阳性癌症的疫苗。

31、优选地，所述hpv阳性癌症包括但不限于宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、前列腺癌、膀胱癌。

32、进一步优选地，所述hpv阳性癌症为宫颈癌。

33、优选地，所述疫苗还包括能够激活免疫反应的抗原或免疫原。

34、优选地，所述疫苗还可以包括任何dna破坏剂。

35、进一步优选地，所述dna破坏剂包括可引起dna损伤的外源性试剂、抑制细胞内源性dna损伤修复的外源性试剂。

36、具体的，所述dna破坏剂选自多柔比星、卡铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、托泊替康、博来霉素、多西他赛、紫杉醇中的至少一种。

37、进一步优选地，所述dna破坏剂选自多柔比星、卡铂、阿霉素中的至少一种。

38、在一些实施例中，所述疫苗被加载到树突状细胞(dc)、抗原呈递细胞(apc)或b细胞中的癌症抗原或癌症免疫原。

39、优选地，所述疫苗还可以包括佐剂。

40、进一步优选地，所述佐剂选自油佐剂、水包油佐剂、油包水佐剂、水包油包水佐剂、铝盐、多糖类佐剂中的至少一种。

41、优选地，所述疫苗中还包括医学上可接受的载体。

42、进一步优选地，所述医学上可接受的载体包括但不限于赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂。

43、具体的，所述赋性剂选自微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、环糊精、羧甲基纤维素、甘露醇中的至少一种。

44、具体的，所述缓冲剂选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵、醋酸钠、枸橼酸盐、组氨酸、琥珀酸盐中的至少一种。

45、具体的，所述乳化剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸铝、硬脂酸甘油酯、聚甘油-4异硬脂酸酯、山梨坦异硬脂酸酯、山梨坦油酸酯、甘油油酸酯、聚甘油-3聚蓖麻醇酸酯中的至少一种。

46、具体的，所述稳定剂选自金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚或羧甲基甲壳酯中的至少一种。

47、具体的，所述稀释剂选自赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖、蔗糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种。

48、具体的，所述粘合剂选自水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

49、具体的，所述防腐剂选自羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞、氧氰化汞、苯氧乙醇、氯己定、苯甲酸、苯甲酸钠、氯甲酚、苯扎溴铵、苯扎氯铵、羟苯乙酯中的至少一种。

50、具体的，所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆中的至少一种。

51、又一方面，本发明提供了上述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽和/或上述的核酸在制备预防和/或治疗hpv阳性癌症疫苗中的应用。

52、又一方面，本发明提供了一种药物组合物。

53、所述药物组合物中包括上述的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽和/或上述的核酸。

54、优选地，所述的药物组合物的药物剂型包括但不限于普通制剂、缓释制剂、控释制剂、靶向制剂、微粒给药系统。

55、进一步优选地，所述药物组合物的剂型为口服及肠胃外给药形式的剂型。

56、优选地，所述口服的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糖浆、滴丸。

57、所述的药物组合物中还包括医学上可接受的载体。

58、优选地，所述医学上可接受的载体选自增溶剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、抗氧剂、助溶剂、ph调节剂、抑菌剂中的至少一种。

59、进一步优选地，所述增溶剂选自淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸中的至少一种。

60、进一步优选地，所述粘合剂选自羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯胶中的至少一种。

61、进一步优选地，所述保湿剂为甘油。

62、进一步优选地，所述崩解剂选自琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、藻酸、复合硅酸盐、碳酸钠中的至少一种。

63、进一步优选地，所述润滑剂选自滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠中的至少一种。

64、进一步优选地，所述吸附剂选自针用活性炭、交联聚维酮、分子筛中的至少一种。

65、进一步优选地，所述抗氧剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、维生素c、谷胱甘肽中的至少一种。

66、进一步优选地，所述助溶剂选自甘油、酒石酸、吐温80、聚乙二醇类、盐酸半胱氨酸中的至少一种。

67、进一步优选地，所述ph调节剂选自柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的至少一种。

68、进一步优选地，所述抑菌剂选自苯酚、甲酚、氯甲酚、三氯叔丁醇、苯甲醇、尼泊金类中的至少一种。

69、优选地，所述药物组合物的给药方式包括但不限于吸入或鼻内给药，直肠给药，口服给药，经粘膜或经皮渗透给药。

70、本发明的有益效果包括：

71、(1)本发明的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽能够有效的诱导ifn-γt细胞免疫应答。

72、(2)本发明的ii-key/hpv16 e7/mhc杂交肽能够有效地促进小鼠脾脏cd4+t细胞和cd8+t细胞，增强了小鼠特异性细胞免疫功能。