一种高选择性灵敏检测镍离子荧光探针、制备方法与应用

1.本发明涉及苯并吲哚衍生的化合物作为镍离子荧光探针，能够对镍离子快速响应特异性识别，或者其可测定样品中镍离子在的浓度，并同时可用于活细胞或者斑马鱼内镍离子的检测；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。


背景技术：

2.镍作为人体必须的微量元素，主要源自蔬菜、谷类食物，以及海带等。但随着大家对生活品质要求的不断提高，各种净化饮水机广受欢迎，但是有些饮水机反复加热水后镍离子含量会增加，金属类餐具反复使用也会导致人体摄入过量的镍。正常情况下，人体血液中镍含量约为0.11ug/ml，当镍含量高于正常标准时，会严重危害人类健康。镍对人体最大的危害就是皮肤，直接影响皮肤的颜色，引发接触性皮炎。皮肤接触镍后，以剧痒为首发症状，随后出现丘疹、疱疹，以及红斑，病情严重者甚至出现溃烂、化脓等炎症反应。
3.有报道称，长期接触镍，容易出现头发变白、沙眼、慢性咽炎等，并且低浓度镍及其化合物与盐酸、氨等的联合毒性作用更大，通过皮肤黏膜、呼吸道，引起皮炎、气管炎，以及肺炎。镍具有致癌性，1990年，镍化合物被世界卫生组织下属的国际癌症研究机构列为一类致癌物。镍对肺和呼吸道有刺激和损害作用，流行性病学调查发现镍化合物可引起镍冶炼工人的鼻癌和肺癌，并且香烟中有含量较高的镍能与烟雾中的一氧化碳结合成四羰基合镍,导致吸烟者更易患肺癌。白血病人血清中镍含量是健康人的2-5倍，且患病程度与血清中镍含量明显相关，暗示着镍也可能是白血病的致病因素之一。由于镍离子的危害性和在生物系统中的重要性，所以对ni
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的监测和定量要求不断增加，需要探寻一种灵敏的检测镍的方法，以期实现对生命体内以及环境中镍离子的原位检测，为探究其生理和病理的过程提供新的方向。
4.近年来，已报到道的检测镍离子的方法有原子吸收光谱法、火焰原子吸收法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法和分光光度法，荧光探针分析法等，其中荧光探针因其高选择、超灵敏、合成简单等独特的优势而成为研究者关注的焦点。目前已报道的荧光探针分析方法仍存在一定的缺陷，例如灵敏度低、选择性差、水溶性差、合成复杂等。因此，发展高选择性高灵敏的镍离子荧光探针成为急需解决的课题。


技术实现要素：

5.本领域急需制备一种简单的高选择超灵敏的镍离子荧光探针，从而能够有效检测镍离子。为此，本发明合成了一类新颖的镍离子荧光探针，其合成简单、选择性好、灵敏度高、能够特异性识别镍离子，并且作为镍离子荧光探针，能够更加准确的实现对镍离子的检测。具体而言，本发明提供了一种新型镍离子荧光探针，其为吲哚盐衍生物类化合物，其结构如下：
[0006][0007]
其中：r1，r2，r3，r4和r5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中r1，r2，r3，r4，r5和r6可以相同或不同。
[0008]
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的荧光探针是r1，r2，r3，r4， r5和r6均为氢原子的式(ⅱ)化合物，其结构式如下：
[0009][0010]
本发明还提供了式(ⅰ)荧光探针的制备方法，以式(ⅲ)和式(iv)化合物为原料，按照如下反应路线进行反应制备：
[0011][0012]
在本发明的一些具体实施方案中，具体制备步骤如下：将式(ⅲ)和式(iv) 化合物溶于乙腈溶液中，再加入一定摩尔比的哌嗪，氮气保护下加热回流反应，反应结束后，真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离，得到纯净的式(ⅰ)化合物。
[0013]
在本发明的一些具体实施方案中，其中所述式(ⅲ)和式(iv)化合物的摩尔比为1:1-1:3。
[0014]
在本发明的一些具体实施方案中，其中所述的回流时间为6个小时。
[0015]
本发明还提供了一种用于测量、检测或筛选镍离子的荧光探针组合物，其包含式(ⅰ)或式(ⅱ)荧光探针。
[0016]
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
[0017]
本发明还提供了一种用于检测样品中镍离子的存在或测定样品中的镍离子含量的方法，其包括：
[0018]
a)使式(ⅰ)或式(ⅱ)荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；
[0019]
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
[0020]
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是水样品、化学样品或生物样品。
[0021]
本发明还提供了式(ⅰ)或式(ⅱ)荧光探针的应用，所述荧光探针制备应用于检测或实时检测生物体内镍离子的试剂。
[0022]
本发明还提供了式(ⅰ)或式(ⅱ)荧光探针在细胞荧光成像的应用。
[0023]
本发明还提供了用于检测样本中镍离子浓度的检测制剂或试剂盒，其包含式(ⅰ)或式(ⅱ)荧光探针。
[0024]
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
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(1)响应时间短，灵敏度高
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本发明的荧光探针与镍离子反应灵敏，检出限低至17nm，反应迅速，三分钟即可到达平台，从而可以实现对镍离子的快速检测，尤其是可用于生物体内镍离子的检测。
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(2)选择性高，抗干扰能力强
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本发明的荧光探针可选择性的与镍离子特异性反应，生成荧光变
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化的产物，相较于常见的其他金属离子如银离子，铝离子，铬离子，铜离子，二价铁离子，三价铁离子，镁离子，锰离子，钠离子，铅离子，锡离子，锌离子，钾离子等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
[0030]
(4)细胞毒性低，可生理水平条件下应用
[0031]
本发明的荧光探针细胞毒性低，有利于在生理水平条件下应用，可以应用于活细胞荧光成像。
[0032]
(5)可生理水平条件下应用
[0033]
本发明的镍离子离子荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。
[0034]
(6)稳定性好
[0035]
本发明的镍离子荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
[0036]
(7)合成简单
[0037]
本发明的镍离子荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
[0038]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0039]
图1是探针(5μm)对镍离子(10μm)在575nm处的时间动力学谱；
[0040]
图2是探针(5μm)加入镍离子(5μm，10μm)前后的吸收光谱；
[0041]
图3是探针(5μm)加入镍离子(0-10μm)前后的荧光光谱；
[0042]
图4是探针(5μm)在575nm处的荧光强度和镍离子(0-4μm)的线性关系图；
[0043]
图5是镍离子(10μm)与其他不同离子分析物(25μm)对探针(5μm)的荧光强度的影响以及在不同离子分析物(25μm)存在下探针(5μm)对镍离子(5μm) 识别后的荧光强度；
[0044]
图6是探针(10μm)在hela细胞中对外源性镍离子的荧光显微成像；
[0045]
图7是探针(10μm)在斑马鱼中对外源性镍离子的荧光显微成像。
具体实施方式
[0046]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0047]
实施例1式(ⅱ)化合物的合成
[0048]
合成路线如下：
[0049][0050]
具体操作步骤如下：
[0051]
实施方案1：将式(ⅲ)(252mg,1mmol)和式(iv)(162mg,1mmol) 以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml乙腈中，氮气保护下加热回流条件下反应6小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的化合物210mg，产率为 53.0％。
[0052]
实施方案2：将式(ⅲ)(252mg,1mmol)和式(iv)(243mg,1.5mmol) 以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml乙腈中，氮气保护下加热回流条件下反应6小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到棕色的纯净的化合物230mg，产率为 58.1％。
[0053]
实施方案3：将式(ⅲ)(252mg,1mmol)和式(iv)(324mg,2mmol) 以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml乙腈中，氮气保护下加热回流条件下反应6小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到棕色的纯净的化合物242mg，产率为 61.1％。
[0054]
实施方案4：将式(ⅲ)(252mg,1mmol)和式(iv)(405mg,2.5mmol) 以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml乙腈中，氮气保护下加热回流条件下反应6小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到棕色的纯净的化合物256mg，产率为 64.6％。
[0055]
实施方案5：将式(ⅲ)(252mg,1mmol)和式(iv)(486mg,3mmol) 以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml乙腈中，氮气保护下加热回流条件下反应6小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到棕色的纯净的化合物282mg，产率为 71.2％。
[0056]
实施例2：测试荧光探针的时间动力学
[0057]
配制一个探针浓度为5μm的10ml的测试体系，然后将10μm的镍离子加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙腈和水溶液(v/v 3:7)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图1所示。
[0058]
由图1可以清楚地看到，当镍离子加入后，荧光强度在三分钟达到最大值并保持不变，这说明该探针与镍离子反应迅速，能够为镍离子的测定提供快速的分析方法。
[0059]
实施例3测试荧光探针加入镍离子前后的吸光光谱
[0060]
配制两个5ml的测试体系，标号为a和b。测试体系b作为对照组，不进行任何操作。在测试体系a中加入探针(5μm)后，用紫外吸收光谱仪进行测定，然后分别加入镍离子(5μm，10μm)，用紫外吸收光谱仪进行测定。上述测定是在乙腈和水溶液(v/v 3:7)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图2所示。
[0061]
从图2可以清晰的看出，当镍离子加入后，探针的吸收峰发生明显的变化。
[0062]
实施例4：测试荧光探针对于镍离子的浓度梯度
[0063]
配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同浓度的镍离子(0-10μm)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙腈和水溶液(v/v 3:7)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图3 和图4所示。
[0064]
从图3可以清晰的看出，随着镍离子浓度的增加，575nm处的荧光强度逐渐降低。并且，由图4可以看出探针(5μm)加入镍离子(0-4μm)之后，其 575nm处的荧光强度的与镍离子浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对镍离子进行定量分析。
[0065]
实施例5：测试荧光探针的选择性及抗干扰性能
[0066]
配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、银离子，铝离子，铬离子，铜离子，二价铁离子，三价铁离子，镁离子，锰离子，钠离子，铅离子，锡离子，锌离子，钾离子，镍离子；除镍离子为5μm外，其他分析物浓度均为25μm)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙腈和水溶液(v/v 3:7)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图5中每组柱状图中的右侧柱状图所示。
[0067]
从图5可以清晰的看出，只有镍离子加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对镍离子具有较高的选择性，有利于对镍离子的检测分析。
[0068]
配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、银离子，铝离子，铬离子，铜离子，二价铁离子，三价铁离子，镁离子，锰离子，钠离子，铅离子，锡离子，锌离子，钾离子，镍离子；除镍离子为5μm外，其他分析物浓度均为25μm)，摇晃均匀后，除了第一个空白组外，其他组分别加入镍离子(浓度为5μm)，摇晃均匀后，用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙腈和水溶液(v/v 3:7)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图5中每组柱状图中的左侧柱状图所示。
[0069]
从图5可以清晰的看出，其他金属离子加入对荧光探针检测镍离子几乎没有干扰，
实验证明，该探针对镍离子具有较高的抗干扰能力，有利于对镍离子的检测分析。
[0070]
实施例6：荧光探针对hela细胞中外源性镍离子的荧光显微成像
[0071]
将hela细胞分成三组，a组作为对照组，仅用探针(10μm)孵育20min； b组先用探针(10μm)孵育20min，再加镍离子(10μm)孵育20min；c组先用探针(10μm)孵育20min，再加镍离子(20μm)孵育20min；最后对三组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图6所示。
[0072]
从图6可以看出，探针本底荧光强度较低，随着镍离子浓度的增强，荧光强度也随之增强，实验结果证明，该探针可以检测hela细胞中外源性的镍离子。
[0073]
实施例7：荧光探针对斑马鱼中外源性镍离子的荧光显微成像
[0074]
将斑马鱼细胞分成三组，a组作为对照组，仅用探针(10μm)孵育20min；b组先用探针(10μm)孵育20min，再加镍离子(10μm)孵育20min；c组先用探针(10μm)孵育20min，再加镍离子(20μm)孵育20min；最后对三组斑马鱼分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图7所示。
[0075]
从图7可以看出，随着镍离子浓度的增强，斑马鱼体内荧光强度也随之增强，从图7可以看出，该探针可以检测斑马鱼细胞中外源性的镍离子；实验证明，该探针可以应用于生物样品中的镍离子检测。
[0076]
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。