1.本发明涉及叶酸提取技术领域，尤其是一种茶叶中天然叶酸的提取方法。
背景技术：
2.茶叶中富含多种生理活性物质，具有良好的药理作用和营养价值。茶所具有的独特营养与保健功能，使其成为世界三大饮料之一，茶产业亦被称为健康产业。随着科技发展，茶树中的有效成分提取技术，新功能拓展，以及新产品开发等许多方面研究成果丰硕，加速了茶树资源的综合利用。
3.叶酸是一种重要的b族维生素，作为人体生长所必需的维生素之一，参与很多重要生物反应。叶酸的缺乏会对人体的健康造成一定的影响，例如导致贫血、胎儿发育缺陷以及心血管疾病等。世界卫生组织建议成人叶酸的需要量至少每天200ng。由于孕妇和乳母的叶酸含量太低容易影响对胎儿或幼儿的健康，因此每天的叶酸需要量多于常人，为400ng。
4.天然叶酸广泛存在于动植物类食品中，尤其是酵母、肝脏以及绿色蔬菜中含量较多。含叶酸的食物虽然很多，但天然叶酸极不稳定，易受阳光、加热等因素的影响而发生氧化，因此人体真正能从食物中获取的叶酸并不多。
5.常用的叶酸提取方法为单酶法和三酶法，单酶法针对菠菜、黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶酸提取有效；三酶法对谷物类、土豆等豆类的叶酸提取有效。三酶法主要是通过α-淀粉酶、蛋白酶水解样品中的淀粉和蛋白质，释放与其结合的5-mthf，再利用叶酸轭合酶，将多谷氨酸叶酸水解为单谷氨酸叶酸，再予以测定，其中叶酸轭合酶通常源自大鼠血清。
6.国家知识产权局于2017年4月12日授权公告的发明专利cn105181829b公开了一种定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其中提及同时添加老鼠血清轭合酶与鸡胰腺轭合酶，可以预防叶酸的氧化破坏，提高去轭合效果。该发明仍然未脱离老鼠血清轭合酶的使用。
技术实现要素：
7.本发明提出一种茶叶中天然叶酸的提取方法，开创性地单独使用鸡胰腺轭合酶，能够有效提高茶叶中天然叶酸提取过程中的酶解效率，提高叶酸提取量。
8.一种茶叶中天然叶酸的提取方法，采用三酶法，其中的叶酸轭合酶源自鸡胰腺血清，α-淀粉酶源自米曲霉，蛋白酶源自链霉菌。
9.进一步的，茶叶中天然叶酸的提取方法，具体包括以下步骤：
10.步骤1，称取0.2g茶叶样品置入ep管中，加入750μl叶酸提取液；
11.步骤2，95℃水浴孵育15min后于冰上冷却，再加入5mm钢珠，置入冷冻研磨机中研磨，得到匀浆液；
12.步骤3，匀浆液中加入750μl叶酸提取液和8-20μlα-淀粉酶，静置10min；
13.步骤4，加入80-100μl蛋白酶，37℃培养1h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却后，在4
℃温度下离心10min，吸取上清液；
14.步骤5，在上清液中加入10μl鸡胰腺血清，混匀后，于37℃温度下培养2h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却后，在4℃温度下离心15min，吸取上清液即得叶酸提取物。
15.本发明的有益效果：1、选择鸡胰腺血清作为叶酸轭合酶的来源，其来源丰富，量多充足；相对于常用的大鼠血清来说，携带动物病毒概率低；有效提高了酶解效率，提高了酶的活性，从而提高了茶叶中叶酸的提取量；2、鸡胰腺叶酸轭合酶作用的最适ph值在7.0和8.5之间，对叶酸轭合酶抑制剂不敏感，能够长期储存；3、将α-淀粉酶、蛋白酶、鸡胰腺叶酸轭合酶依次单独加入，避免共同加入存在酶活性被抑制的可能，进一步提高了酶解效率。
具体实施方式
16.下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
17.实施例1
18.一种茶叶中天然叶酸的提取方法，包括以下步骤：
19.1、称取0.2g茶叶样品置入2ml ep管中，加入750μl叶酸提取液；
20.2、95℃水浴孵育15min后于冰上冷却，再加入5mm钢珠，置入冷冻研磨机中研磨(转速14000r/min，时长5min)，得到匀浆液；
21.3、匀浆液中加入750μl叶酸提取液和4-8μlα-淀粉酶，静置10min；
22.4、加入100μl蛋白酶，37℃培养1h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却后，在4℃温度下离心10min(转速14000r/min)，吸取上清液；
23.5、在上清液中加入10μl鸡胰腺血清，混匀后，于37℃温度下培养2h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却1h后，在4℃温度下离心15min(转速14000r/min)，吸取上清液即得叶酸提取物。
24.实施例2
25.一种茶叶中天然叶酸的提取方法，包括以下步骤：
26.1、称取0.2g茶叶样品置入2ml ep管中，加入750μl叶酸提取液；
27.2、95℃水浴孵育15min后于冰上冷却，再加入5mm钢珠，置入冷冻研磨机中研磨(转速14000r/min，时长5min)，得到匀浆液；
28.3、匀浆液中加入750μl叶酸提取液和20μlα-淀粉酶，静置10min；
29.4、加入80μl蛋白酶，37℃培养1h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却后，在4℃温度下离心10min(转速14000r/min)，吸取上清液；
30.6、在上清液中加入10μl鸡胰腺血清，混匀后，于37℃温度下培养2h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却1h后，在4℃温度下离心15min(转速14000r/min)，吸取上清液即得叶酸提取物。
31.对比例1
32.将实施例1中的10μl鸡胰腺血清替换为10μl大鼠血清。
33.对比例2
34.将实施例2中的10μl鸡胰腺血清替换为10μl大鼠血清。
35.对比例3
36.将实施例1中的10μl鸡胰腺血清替换为9.5μl鸡胰腺血清与0.5μl大鼠血清混合物。
37.对比例4
38.将实施例2中的分别加入α-淀粉酶、蛋白酶和鸡胰腺血清替换为将α-淀粉酶、蛋白酶和鸡胰腺血清混合后加入，具体步骤调整为：
39.1、称取0.2g茶叶样品置入2ml ep管中，加入750μl叶酸提取液；
40.2、95℃水浴孵育15min后于冰上冷却，再加入5mm钢珠，置入冷冻研磨机中研磨(转速14000r/min，时长5min)，得到匀浆液；
41.3、匀浆液中加入750μl叶酸提取液和20μlα-淀粉酶、80μl蛋白酶、10μl鸡胰腺血清静置10min，37℃培养2h，100℃煮沸灭活10min，冰上冷却后，在4℃温度下离心15min(转速14000r/min)，吸取上清液即得叶酸提取物。
42.下面使用微生物法对实施例1-2和对比例1-4所提取的叶酸含量进行检测，每个实施例和对比例分别配置5组，得到的结果记录在下表1。
[0043] 总叶酸含量实施例1301.2
±
0.87μg/100g实施例2291.8
±
1.1μg/100g对比例1289.2
±
2.3μg/100g对比例2276.7
±
2.3μg/100g对比例3295.1
±
2.3μg/100g对比例4283.5
±
0.9μg/100g
[0044]
对比实施例1与对比例1以及实施例2与对比例2可知，单独使用鸡胰腺叶酸轭合酶比单独使用大鼠叶酸轭合酶，叶酸提取效果更优。
[0045]
对比实施例1与对比例3可知，单独使用鸡胰腺叶酸轭合酶比使用大鼠叶酸轭合酶与鸡胰腺叶酸轭合酶的混合酶，叶酸提取效果更优。
[0046]
对比实施例2与对比例4可知，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶和鸡胰腺血清相较于将α-淀粉酶、蛋白酶和鸡胰腺血清同时加入，叶酸提取效果更优。
[0047]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。