与葡萄花性别关联的SNP位点及应用

与葡萄花性别关联的snp位点及应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与葡萄花性别关联的snp位点及应用。


背景技术：

2.葡萄花的性别可以分为雄花，雌能花和两性花，通过对花的性别早期的预测可以提前筛选出是两性花的优异植株，减少栽培成本，为葡萄育种奠定基础。发掘葡萄性别相关的基因，开发与葡萄性别紧密相关的分子标记，通过分子标记辅助选择利用新基因或与已知优良基因进行聚合对于培育优良的葡萄品种具有重要的意义。目前，葡萄已知的花性控制的区域主要在2号染色体的sex-determining region(sdr)约5m的区域(dalb
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et al.，2000，lowe and walker，2006，riaz et al.，2006，marguerit et al.，2009，battilana et al.， 2013)。控制雄花的基因主要有vviyabby3和vvisku5两个基因，从 trehalose-6-phosphate phosphatase(tpp)到wrky21，11个基因位于葡萄的雌花区域(zou et al.，2020)。
3.本研究基于200k snp芯片检测的单核苷酸多态性标记(single nucleotidepolymorphisms，snps)，通过gwas进行基因型与表型性状的相关性分析，筛选出与目标性状关联的snps标记，进而定位出与目标性状相关的候选基因。本技术发明人前期已成功完成了335份葡萄自然群体的重测序，以及463份4个f1群体(北红x es7-11-49，北丰x烟73，北醇x康可的正反交群体)材料200k芯片的开发以及设计，获得了大量高质量snps，其中f1群体的snps可用于遗传图谱的构建，为葡萄种质资源的鉴定提供重要保障。本发明利用基于200k芯片的snps的gwas分析，鉴定到控制葡萄花性别的候选基因cyp1(vit_05s0094g01190)基因的自然变异与葡萄花性别高度关联。然后我们对该基因的显著相关的位点进行和性状的显著性分析发现，该位点的碱基类型和葡萄的花的性别呈显著相关。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种与葡萄花性别关联的snp位点及应用。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.与葡萄花性别关联的snp位点，所述snp位点位于葡萄参考基因组(pn40024，v2)5 号染色体上第24,498,562位(chr5：24,498,562)，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为“gg”、“tt”或“gt”，该位点位于基因的内含子区。
7.经过分析，找到了与葡萄花性别关联的基因为vit_05s0094g01190，命名为cyp1。
8.本发明通过与葡萄花性别关联的snp位点，可以辅助鉴定葡萄花性别，可以在早期预测和筛选葡萄的花性别。
9.本发明利用snp(chr5：24,498,562)，对463份杂交群体以及335份自然群体的花性性状进行分型发现基因型为“gg”的材料共有130份，其中雌能花个体109个(84％)，其余21个样品为两性花，基因型为“tt”的材料共有321份，其中两性花个体312个(97％)，其中9个
样品为雌能花，基因型为“gt”的材料共有236份，其中两性花个体214个(91％)，雌能花21个，雄花1个，这些结果说明，该snpsnp(chr5：24,498,562)能较好的用来区分花的性别。
10.另外，本发明还保护与葡萄花性别关联的snp位点在葡萄辅助育种中的应用，以及定位与葡萄花性别紧密连锁的基因方面的应用。
11.另外，本发明还公开了一种与葡萄性状关联的snp位点与葡萄花性别相关的gwas分析方法，具体包括以下步骤：
12.1)根据314份重测序样本的测序结果，进行原始数据处理，以及snp的筛选，获得500,724高质量的snps，用于463份葡萄200k芯片的设计；
13.2)最终获得174,464snps，分别对463份总样本群体，以及其中的三个f1群体(北红xes7-11-49，北丰x烟73，北醇x康可的正反交)进行花性别的全基因组关联分析；使用plink(versionv1.90b6.24)进行missing＜10％，maf＞0.01的数据筛选，分别对463份总的样本，以及北红xes7-11-49，北丰x烟73，北醇x康可的正反交群体进行snp的筛选，最终分别使用155,404，130,917，80,560,102,191snps用于全基因组关联分析。
14.4)进一步使用gec进行显著性阈值的确定，463份样本的显著性阈值为6.0，北红xes7-11-49群体的显著性阈值为5.7，北丰x烟73群体显著性阈值5.5，北醇x康可正反交群体显著阈值5.6；
15.5)使用tassel的glm模型，进行全基因组关联分析；全基因组关联分析结果显示除了已知的2号染色体，5号染色体新发现了一个和花性显著相关的位点；
16.6)我们发现在5号染色体第24,498,562位(chr5：24,498,562)，该位置的碱基为纯和“gg”的时候多为雌花，碱基为“gt”或者“tt”的时候多为两性花，该位置碱基的变异和花性有显著相关性。
17.本发明的优点：
18.本发明鉴定到一个与葡萄花性相关联的snp位点，为葡萄的分子标记育种奠定了基础。本发明利用基于200k芯片的gwas的分析，鉴定到了和花性相关联的snp位点和候选基因cyp1，该位点可以用于葡萄两性花材料的分子标记辅助育种。而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的snp位点在两性花葡萄新品种培育中具有较好的应用价值。
19.另外，由于分子标记对于最终功能基因定位具有十分重要意义，鉴定该基因的结构有助于帮助我们理解该基因的进化与生物学功能，同时为分子标记辅助育种以及育种奠定基础，加上snp位点在分子标记育种体系建立中具有简便、快速、高通量的优势，因而使得本技术具有十分重要的应用价值，对于葡萄新品种培育也具有十分重要的保护意义。
附图说明
20.图1为基于314份重测序样品200k芯片的开发流程；
21.图2为基于463份样品群体，北红xes7-11-49群体，北丰x烟73群体，北醇x康可正反交群体对葡萄花性进行的全基因组关联分析；
22.图3为在463份样品中花的性别和该位置的碱基显著性差异分析结果。1代表雌能花，0代表两性花；
23.图4为在335份自然群体中花的性别和该位置碱基显著性差异分析的结果。1代表
雌能花，0代表两性花，-1代表雄花；
具体实施方式
24.下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
25.如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
26.本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
27.本发明所采用的生物材料均是现有技术中公开的材料，并且在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。
28.一、实验材料
29.对463份葡萄样品的幼叶进行采样，该样品分别来自北红xes7-11-49群体，北丰x烟73群体，北醇x康可正反交群体f1代。
30.二、花性调查
31.在每年葡萄开花季节对花性进行调查，并记录。
32.三、葡萄叶片dna提取
33.将采取的样品立即放入液氮，冻-80冰箱，采用磁珠法对葡萄叶子的dna进行提取。
34.四.根据314份重测序样本获得的snps进行200ksnp芯片设计。
35.五、于affymetrix获得200ksnp基因芯片。
36.六、对花的性别进行gwas分析
37.基于snp进行全基因组关联分析，首先使用plink(versionv1.90b6.24)，窗口为50snps，r2为0.2(purcelletai.，2007)进行snp的筛选，获得高质量snp后对这些snp使用gec(lietal.，2012)进行阈值的矫正计算。采用tassel的glm模型进行花性的gwas，pca和kinship由tassel生成用于gwas分析。
38.更加具体地，本发明通过以下方式，获得了一个在5号染色体上与花的性别相关的snp位点：
39.1)根据314份重测序样本的测序结果，进行原始数据处理，以及snp的筛选，获得500,724高质量的snps，用于463份葡萄200k芯片的设计；
40.2)进一步经过affymetrix平台的筛选初定204,860snps用于200k芯片，由于葡萄属于高杂合作物，最终实际获得174,464snps；
41.3)分别对463份总样本群体，以及其中的四个f1群体(北红xes7-11-49，北丰x烟73，北醇x康可的正反交)进行花性别的全基因组关联分析。使用plink(versionv1.90b6.24)(purcelletal.，2007)进行missing＜10％，maf＞0.01的数据筛选标准，分别对463份总的样本，以及北红xes7-11-49，北丰x烟73，北醇x康可的正反交群体进行snp的筛选，最终分别使用155,404，130,917，80,560,102,191snps用于全基因组关联分
析；
42.4)进一步使用gec进行显著性阈值的确定，463份样本的建议阈值为4.7，显著性阈值为6.0，北红x es7-11-49群体的建议阈值为4.4，显著性阈值为5.7，北丰x烟73群体建议阈值4.2，显著性阈值5.5。北醇x康可正反交群体建议阈值4.3，显著阈值5.6。
43.5)使用tassel的glm模型，进行全基因组关联分析。全基因组关联分析结果显示除了已知的2号染色体，5号染色体新发现了一个和花性显著相关的位点。该位点的-logp 值在463个群体，北红x es7-11-49群体，北丰x烟73群体，北醇x康可正反交群体分别为73.6，11.6，58.6，9.6。
44.6)本发明利用463份葡萄200k芯片，对葡萄花的性别进行全基因组关联分析，结果显示除已报导的在2号染色体大约4m的距离关于花的性别的区段，还发现了在5号染色体和花的性别相关的snp位点。该位点的-logp值远高于显著性阈值，说明该位点的snp更可能显著与花性相关(图2)。
45.本发明利用snp位点(chr5：24,498,562)，对463份杂交群体(统计结果见表1)以及 335份自然群体(统计结果见表2)的花性性状进行分型发现基因型为“gg”的材料共有 130份，其中雌能花个体109个(84％)，其余21个样品为两性花，基因型为“tt”的材料共有321份，其中两性花个体312个(97％)，其中9个样品为雌能花，基因型为“gt”的材料共有236份，其中两性花个体214个(91％)，雌能花21个，雄花1个，这些结果说明，该snp snp(chr5：24,498,562)能较好的用来区分花的性别，可以用来辅助鉴定葡萄的花性别，对葡萄两性花的选育具有十分重要的指导作用。
46.表1 snp(chr5：24,498,562)基因型与gwas群体(463份杂交群体)花性的关系
[0047][0048]
表2 snp(chr5：24，498，562)基因型与335份自然群体花性的关系
[0049][0050]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0051]
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