一种柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆的构建方法与流程

一种柯萨奇病毒a10型cdna感染性克隆的构建方法
技术领域
1.本发明涉及rna病毒拯救技术，特别涉及一种柯萨奇病毒a10型cdna感染性克隆的构建方法，属于医学生物学技术领域。


背景技术：

2.hfmd病原谱组成复杂多变，由柯萨奇病毒a10(cva10)型引起的hfmd暴发逐渐增多，且经常与其他肠道病毒共传播，这对手足口病的防控提出了新的挑战。临床资料表明，cva10感染一般导致轻度和自限性的疾病症状，包括发烧、口腔溃疡、手脚皮疹或水泡疹，国内外也有病毒性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹，神经呼吸综合征甚至死亡等重症病例的报道。cva10在2010年法国和2013年中国武汉分别引起hfmd暴发流行。由于近年来cva10感染的发病率和严重程度都有所增加，而肠道病毒的遗传物质在流行中易发生变异，导致流行毒株及其引发的hfmd症状的复杂性，因此，由cva10感染导致的hfmd的疾病负担可能被严重低估，加强对cva10等hfmd主要病原的相关研究对疾病的防控具有重要意义。
3.对rna病毒来说，rna分子在体外极易被降解，而且不能像dna分子一样通过分子生物学技术手段进行修饰与改造，因此对rna病毒的分子生物学研究进展相对缓慢，应用反向遗传学技术构建cdna感染性克隆，可以实现在dna水平上对病毒基因组进行改造，如定点突变、重组、缺失、插入和嵌合报告基因等，为研究病毒的基因结构和功能、病毒的致病机制及疫苗的研发奠定良好的基础。目前，反向遗传学技术已广泛应用于多种肠道病毒分子生物学研究和新型疫苗载体的构建等研究领域，包括脊髓灰质炎病毒，肠道病毒71型，柯萨奇病毒a6型，埃可病毒等，但是关于cva10感染性克隆体系的建立和研究还很少，针对cva10病毒的特效药物和疫苗仍未被发现，因此,关于cva10病毒的致病机制仍需科研人员进行更深入的研究。
4.构建感染性克隆的实际操作中有不少困难，其中一个主要难点是基因组和载体片段的连接，首先在获得全长cdna序列的操作过程中可能会引入非基因组序列，其次，如果插入的基因组片段比较大(7.4kb)，载体连接和转化效率都会相应下降，因此，构建cva10病毒的cdna感染性克隆需要维持基因组的稳定性和拯救病毒的感染性。


技术实现要素：

5.针对现有cva10病毒cdna感染性克隆系统在构建和病毒拯救过程中存在的不足和问题，本发明的第一个目的是提供一株cva10中国临床分离株序列，对该病毒的vp1序列进行遗传进化分析，完善中国cva10病毒基因信息。本发明的第二个目的是提供本发明所述的cva10中国临床分离株感染性克隆及其构建方法，为今后cva10病毒反向遗传学技术的广泛应用提供思路。
6.本发明通过以下技术方案完成：
7.本发明提供一种柯萨奇病毒a10型cdna感染性克隆的构建方法，所述方法包括如下步骤：
8.(1)以柯萨奇病毒a10型的病毒rna为模板，以oligo(dt)为第一链引物，通过反转录得到第一链cdna；再以所述第一链cdna为模板，利用含酶切位点a和t7启动子序列的上游引物以及含酶切位点b和poly-a尾的下游引物进行pcr扩增，所得产物纯化后，得到双链dna；
9.其中，酶切位点a和酶切位点b可以相同，也可以不同，其作用在于方便对后续得到的质粒进行酶切，分离目的片段和载体片段。
10.(2)根据topo-ta克隆原理将步骤(1)所得双链dna插入pcr-xl-2-topo
tm
载体，得到cva10基因组全长cdna克隆质粒；
11.(3)步骤(2)所得cva10基因组全长cdna克隆质粒用与所述酶切位点a、酶切位点b对应的限制性内切酶线性化，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化后，所得cva10基因组全长cdna片段进行转录，所得转录产物纯化后转染宿主细胞(如vero细胞)，进行传代培养，当观察到与柯萨奇病毒a10型毒株一致的肠道病毒致细胞病变现象，收集细胞培养液，提取出所述柯萨奇病毒a10型cdna感染性克隆。
12.进一步，所述柯萨奇病毒a10型为cva10-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：v202226，保藏日期：2022年4月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
13.进一步，步骤(1)中所述柯萨奇病毒a10型的病毒rna采用病毒rna提取试剂盒提取。
14.上述所有反转录都采用试剂盒prime script
tm
ⅱꢀ
1st strand cdna synthesis kit完成。
15.在本发明的一个实施例中，所述酶切位点a为限制性内切酶salⅰ的酶切位点，所述酶切位点b为限制性内切酶not
ꢀⅰ
的酶切位点。
16.具体地，步骤(1)中所述含酶切位点a和t7启动子序列的上游引物的核苷酸序列为gtcgactaatacgactcactatagggttaaaacagcctgtgggttg；
17.所述含酶切位点b和poly-a尾的下游引物为gcggccgcttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgctattctggttataacaaatttac。
18.进一步，步骤(3)中所述转录采用in vitro transcription t7 kit试剂盒。
19.进一步，步骤(3)中所述转染用lipofectamin 3000试剂盒完成。
20.进一步具体地，在本发明的一个实施例中，所述方法包括：
21.s1、cva10病毒的分离：将含柯萨奇病毒a10型的样本在dmem培养液中充分搅动吹打，用0.2μm无菌滤膜过滤除菌；所得滤液接种到长满单层的vero细胞上，使完全覆盖细胞，37℃，5.0％ co2恒温培养箱中吸附2h后补加细胞维持液，继续培养；待有75％～100％细胞出现病变并脱落后，无菌收集病毒液，收获的病毒液反复冻融3次，(6000g)离心(30min)，以0.2μm无菌滤膜过滤，得到病毒液；
22.s2、cva10全长cdna克隆的构建：使用qiaamp viral rna mini kit提取步骤s1中所述病毒液中的病毒rna，以所述病毒rna为模板，以oligodt为第一链引物，经primescript
tm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录出第一链cdna；以上游引物a10-sali-t7-f和下游引物a10-a-not-r使用prime star gxl高保真聚合酶对所述第一链cdna进行pcr扩增，所得pcr产物经纯化，得到目的片段；
23.上游引物a10-sali-t7-f：
24.gtcgactaatacgactcactatagggttaaaacagcctgtgggttg
25.下游引物a10-a-not-r：
26.gcggccgcttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgctattctggttataacaaatttac
27.本发明利用高保真长片段dna聚合酶扩增病毒基因组cdna来降低pcr反应的错配率从而提高片段的保真性。一定长度的poly(a)尾巴对维持rna病毒基因组结构的稳定性和感染性具有重要作用。不同病毒要求的poly(a)长度不同，但都要求在一定范围之内，本发明通过利用pcr引物在病毒基因组3’utr末端引入40个a。体外转录首先要选择合适的启动子,本发明选用t7启动子并利用t7聚合酶系统进行体外转录。在启动子和病毒基因组cdna之间最好无其他序列，本发明利用pcr引物在病毒基因组cdna序列的5’端引入了t7启动子序列。体外转录反应存在一个在何处终止的问题,本发明利用pcr引物在3’端poly(a)末尾增加了一个限制性内切酶位点,将重组质粒线性化后体外转录反应就可以正确终止。再将扩增片段插入topo-xl-pcr载体，进行salⅰ和notⅰ双酶切鉴定，将鉴定正确的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
28.s3:cva10病毒拯救：将所述目的片段根据topo-ta克隆原理插入pcr-xl-2-topo
tm
载体，得到目的质粒；用限制性内切酶sal
ꢀⅰ
和not
ꢀⅰ
将所述目的质粒双酶切线性化，经(1％)琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后，采用in vitro transcription t7 kit体外转录出病毒基因组rna，所得转录产物经rneasy mini kit纯化试剂盒纯化后，用lipofectamin 3000转染12孔板的vero细胞，当细胞病变达80％以上时，从细胞培养基中提取得到所述柯萨奇病毒a10型cdna感染性克隆。
29.同时设野生型cva10感染组及正常vero细胞组(未感染)，以判断cva10病毒的致细胞病变效应。
30.拯救病毒的鉴定：收集出现细胞病变效应的细胞培养液，使用qiaamp viral rna mini kit说明书操作提取病毒rna，以提取的cva10基因组正链rna为模板，以cva10-vp1-f为上游引物、cva10-vp1-r为下游引物对病毒结构蛋白vp1的编码序列进行rt-pcr。将扩增的vp1序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：提供一株cva10中国临床分离株序列，对该病毒的vp1序列进行遗传进化分析，完善中国cva10病毒基因信息。提供本发明所述的cva10中国临床分离株感染性克隆及其构建方法，大大简化了cva10病毒的反向遗传学操作步骤，为今后cva10病毒及其他肠道病毒反向遗传学技术的广泛应用提供了更简便的平台，并设计了7对引物对病毒全基因组进行测序分析，可应用于cva10重要毒株的全基因组序列获取和病毒特性分析，从序列到克隆方法上都填补了国内肠道病毒研究的空白。
附图说明
32.图1.基于vp1序列的cva10病毒系统进化树
33.图2.cva10-4病毒株基因组全长cdna的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后的图谱；其中m为dl 10000的琼脂糖凝胶电泳dna marker
34.图3.cva10-4病毒株基因组全长cdna感染性克隆用限制性内切酶sal
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和not
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双酶切线性化，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱
35.图4.cva10-4拯救病毒感染vero细胞后的致细胞病变现象，a为拯救病毒感染vero细胞结果，b为cva10母本野生型病毒感染vero细胞结果，c为
36.正常细胞阴性对照
37.图5.对cva10-4拯救病毒结构蛋白vp1序列进行rt-pcr鉴定，rt-pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后的图谱，其中m为dl 2000的琼脂糖凝胶电泳dna marker
具体实施方式
38.实施例1.病毒遗传进化分析：
39.所用的cva10病毒株是2017年浦江县疾病预防控制中心从hfmd患者的咽拭子样品中分离得到的cva10临床分离株，命名为cva10-4(genbank id：mn642090)，毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：v202226，保藏日期：2022年4月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
40.将cva10-4病毒株接种到长满单层的vero细胞上，使完全覆盖细胞，37℃，5.0％ co2恒温培养箱中吸附2h后补加细胞维持液，35℃，5.0％co2恒温培养箱中继续培养；在倒置显微镜下，每天观察细胞瓶是否出现致细胞病变效应(cpe)，并记录cpe出现和变化情况(1+，《25％；2+，25％～50％；3+，50％～75％；4+，75％～100％)，至少观察一周；待有75％～100％(4+)细胞出现病变并脱落后，无菌收集病毒液，收获的病毒液反复冻融3次，6000g离心30min，以0.2μm无菌滤膜过滤，分装保存于-80℃。
41.取分装后的病毒分离培养液，使用病毒rna提取试剂盒提取病毒分离培养液中的病毒rna，使用prime script
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1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒将提取到的病毒rna反转录为cdna。以其为模板，设计7对引物(表1所示)同时测序，通过全序列的同源比对和拼接获得感染性克隆的全基因组序列7361bp(seq id no.1所示)，基于cva10病毒的vp1蛋白的编码序列(seq id no.2所示)，以genbank中收录的cva10国外分离株和中国部分地区分离株为参考，进行遗传进化分析。由图1的系统进化树可以看出，病毒株cva10-4与中国的主要流行株的趋势一致，为cva10病毒基因型的e型。
42.表1.7对引物序列：
43.[0044][0045]
实施例2.cva10病毒株核苷酸及氨基酸同源性比较：
[0046]
将cva10-4病毒株的vp1序列与genbank中得到的cva10各基因(亚)型代表株的vp1序列进行核苷酸与氨基酸序列的同源性比较。核苷酸同源性比较结果显示，cva10-4病毒株同cva10原型株kowalik核苷酸同源性最低，为77％；而与e型株kx595288同源性最高，为97％。这些核苷酸的差异导致氨基酸的相应改变，其中cva10-4病毒株与cva10原型株kowalik的氨基酸差异为：t2a，v39m，t47a，n50s，t76a，y117f，l192q，i205a，k208r,e209v，v230i。cva10-4病毒株与kx595288株的氨基酸差异为：i205v，k208r。上述氨基酸位点的改变发生于病毒在人群中的自然传播过程中，可能与病毒对人体的感染能力或是对病毒毒力的改变有关。
[0047]
实施例3.cva10基因组全长cdna的扩增：
[0048]
将cva10-4病毒株接种到长满单层的vero细胞上，使完全覆盖细胞，37℃，5.0％ co2恒温培养箱中吸附2h后补加细胞维持液，35℃，5.0％co2恒温培养箱中继续培养；在倒置显微镜下，每天观察细胞瓶是否出现致细胞病变效应(cpe)，并记录cpe出现和变化情况(1+，《25％；2+，25％～50％；3+，50％～75％；4+，75％～100％)，至少观察一周；待有75％～100％(4+)细胞出现病变并脱落后，无菌收集病毒液，收获的病毒液反复冻融3次，6000g离心30min，以0.2μm无菌滤膜过滤，分装保存于-80℃。
[0049]
取分装后的病毒分离培养液，使用病毒rna提取试剂盒提取病毒rna，以提取到的病毒rna为模板，以oligodt为第一链引物，经primescript
tm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录出第一链cdna；使用prime star gxl高保真聚合酶对病毒全基因进行pcr扩增，在pcr引物设计中在上游引物加入salⅰ酶切位点和t7启动子序列，在下游引物中加入notⅰ酶切位点和poly-a尾，
[0050]
具体引物序列如下：
[0051]
上游引物a10-sali-t7-f：
[0052]
gtcgactaatacgactcactatagggttaaaacagcctgtgggttg
[0053]
下游引物a10-a-not-r：
[0054]
gcggccgcttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgctattctggttataacaaatttac
[0055]
配置如下反应体系：
[0056][0057]
pcr扩增程序：95℃，4分钟；以98℃10秒，55℃10秒为一个循环，共35个循环；终末延伸68℃10min后结束反应。
[0058]
琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2，pcr产物片段大小约为7500bp。
[0059]
实施例4.cva10全长cdna克隆的构建：
[0060]
将实例3中获得的基因组扩增产物纯化后根据topo-ta克隆原理插入pcr-xl-2-topo
tm
载体，用限制性内切酶sal
ꢀⅰ
和not
ꢀⅰ
将cva10基因组全长cdna克隆质粒双酶切线性化，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见cva10-4全长cdna的目的条带大小为7500bp，以及质粒pcr-xl-2-topo
tm
载体的条带的大小约3900bp，酶切结果见图3，经过测序验证，本次实验构建的克隆序列与其母本病毒的序列完全一致。
[0061]
实施例5.cva10拯救病毒的鉴定：
[0062]
用限制性内切酶sal
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和not
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将cva10-4病毒株基因组全长cdna克隆质粒双酶切线性化，经1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后，所得线性片段采用in vitro transcription t7 kit体外转录出病毒基因组rna，转录产物经rneasy mini kit纯化试剂盒纯化后，纯化后的病毒基因组rna使用lipofectamin 3000转染12孔板的vero细胞，每天于显微镜下观察细胞病变情况，培养至第7天，继续盲传两代，无菌收集细胞培养上清液接种到长满单层的vero细胞上，35℃，5.0％co2恒温培养箱中继续培养，在拯救病毒传至第三代时可以看到与cva10母本野生型病毒株一致的典型的肠道病毒致细胞病变现象(cpe)，如图4，包括细胞皱缩，变圆，脱落等现象，这一结果说明拯救病毒(cva10-4)基因组可以在vero细胞中进行正常复制，具有感染性。收集出现细胞病变效应的细胞培养液，使用qiaamp viral rna mini kit说明书操作提取病毒rna，以其为模板，使用上游引物cva10-vp1-f：acaagctgtgttgcaaggtga、下游引物cva10-vp1-r：cgccagattgttgcccaaattt对病毒结构蛋白vp1的编码序列进行rt-pcr。rt-pcr的产物通过电泳鉴定可见，vp1基因片段大小894bp，琼脂糖凝胶电泳成像的结果如图5。
[0063]
cva10-4病毒株拼接后的全基因组序列seq id no.1
[0064]
ttgttatgtggtaatcagttctgcggaatctttgtgtgcctgttttataaccctcccccgaaatttgcaacttagaagttatgcacgttacagatcaatagcaggcgtggcacaccagccatgtcttgatcaagcacttctgtgaccccggactgagtatcaatagactgctcacgtggtcgaaggagaaaacgttcgttatccggctaactacttcgagaaa
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