聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸及应用

本发明属于生物医用高分子，具体涉及一种聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸及应用，以同时实现高效的抗菌抗癌效果。

背景技术：

1、致病型细菌严重威胁着人类健康。青霉素等传统抗生素一度为人类抵抗细菌感染提供了有力保障。但由于其杀菌机理的局限以及盲目的滥用，日益严峻的细菌耐药性问题再度成为急需解决的难题。然而研制新的抗生素研发成本高，有效周期短，经济效益低，因此存在于生物体内的抗菌肽自发现以来就被认为是抗生素的有力替代者。

2、抗菌肽是生物体非特异性免疫的重要组成部分，一般为结构复杂的短肽，具有热稳定性高、水溶性好、抗菌谱广等诸多优点。抗菌肽具有阳离子性和两亲性结构特征，因此多数研究认为抗菌肽主要通过膜破坏机理实现抗菌效果，即通过静电作用吸附于带负电的细菌细胞膜，破坏其完整性并诱导穿孔，造成细胞内容物溢出胞外导致细菌死亡。

3、由于肿瘤细胞膜相较于正常体细胞具有较高密度的负电荷，因此抗菌肽的抗肿瘤性能也在近年来得到证实，例如爪蟾素、天蚕素等。研究表明，这些天然抗菌肽既可以实现对膜的破坏作用，也能特异性诱导肿瘤细胞凋亡。

4、然而无论是天然抗菌肽的抗菌、抗肿瘤应用都面临相同的挑战，即如何降低生物毒性、如何在体内仍然保证抗菌抗癌活性等。通过模拟天然抗菌肽结构特点，人工设计合成类抗菌肽是解决上述问题的重要手段之一。然而目前人工合成的类抗菌肽的临床应用也面临着如下困境：一是依赖于特定的氨基酸序列结构，提高了合成难度；二是如何同时实现良好的抗菌效果的同时实现抗癌效果；三是短肽的研究进展缓慢，急需新的方向指导。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸及应用。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、目的之一，提供了一种超支化梳型聚赖氨酸，其结构式如下：

4、

5、其中，n表示ε-聚赖氨酸的聚合度，选自10-40(优选为20-30)中的整数；m表示迭代次数，选自1-5中的整数，lys表示赖氨酸结构单元，其结构式如下：

6、

7、目的之二，提供了一种上述的超支化梳型聚赖氨酸的制备方法，其包括如下步骤：

8、(1)、将两个氨基被保护的赖氨酸、缩水剂以及活化助剂在有机溶剂内反应，得到赖氨酸活化酯，其结构式如下：

9、

10、其中，pg表示氨基保护基团，选自苄氧羰基、叔丁基氧羰基、芴甲氧羰基中的一种以上；

11、(2)、将步骤(1)的赖氨酸活化酯加入有机溶剂溶解，加入ε-聚赖氨酸的水溶液反应，脱除氨基保护后得到超支化梳型聚赖氨，其中m＝1；

12、(3)、将步骤(1)的赖氨酸活化酯加入有机溶剂溶解，加入步骤(2)的超支化梳型聚赖氨反应，脱除氨基保护后得到超支化梳型聚赖氨，其中m＝2；

13、(4)、将步骤(1)的赖氨酸活化酯加入有机溶剂溶解，加入步骤(3)的超支化梳型聚赖氨反应，脱除氨基保护后得到超支化梳型聚赖氨，其中m＝3；

14、(5)、将步骤(1)的赖氨酸活化酯加入有机溶剂溶解，加入步骤(4)的超支化梳型聚赖氨反应，脱除氨基保护后得到超支化梳型聚赖氨，其中m＝4；

15、(6)、将步骤(5)的赖氨酸活化酯加入有机溶剂溶解，加入步骤(5)的超支化梳型聚赖氨反应，脱除氨基保护后得到超支化梳型聚赖氨酸，其中m＝5。

16、其中，步骤(2)至步骤(6)中，反应的温度为0-30℃，反应的时间为3-24h。

17、优选地，步骤(1)中，缩水剂选自n,n’-二异丙基碳二亚胺、n,n’-二环己基碳二亚胺、n,n'-二(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺、n,n'-二苯基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐中的一种以上。

18、优选地，步骤(1)中，活化助剂选自n-羟基邻苯二甲酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三氮唑、n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑、4-n,n-二甲基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、n,n-二异丙基乙胺、n-甲基吗啉中的一种以上。

19、优选地，步骤(1)至步骤(6)中，有机溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的一种以上。

20、目的之三，提供了一种利用上述的超支化梳型聚赖氨酸进行聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸，其结构式如下：

21、

22、其中，x表示聚己内酯的聚合度，选自10-50中的整数；a表示聚己内酯未接枝的超支化聚赖氨酸单元的数量，选自1-30中的整数；b表示聚己内酯接枝的超支化梳型聚赖氨酸单元的数量，选自1-30中的整数；结合超支化梳型聚赖氨酸中的结构式，则a+b＝n；

23、linker表示偶联基团，具体选自括甲苯二异氰酸酯残基、异佛尔酮二异氰酸酯残基、六亚甲基二异氰酸酯残基、二苯基甲烷二异氰酸酯残基、二环己基甲烷二异氰酸酯残基中的一种以上，其结构式分别如下

24、

25、ran表示两个结构单元以无规共聚方式连接，m表示迭代次数，选自1-5中的整数，lys表示赖氨酸结构单元，其结构式如下：

26、

27、目的之四，提供了一种上述的聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸的制备方法，其包括如下步骤：

28、(1)、将聚己内酯溶于有机溶剂中，并滴加入偶联剂中反应得到聚己内酯中间体溶液；

29、(2)、将聚己内酯中间体溶液加入上述的超支化梳型聚赖氨酸的水溶液中反应，蒸干后得到聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸。

30、优选地，步骤(1)中，有机溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷中的一种以上。

31、优选地，步骤(1)中，偶联剂选自甲苯二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯、二环己基甲烷二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯中的一种以上。

32、优选地，步骤(2)中，聚己内酯中间体溶液与超支化梳型聚赖氨酸的投料摩尔比为(1-30)：1。

33、目的之五，提供了一种上述的聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸在制备抗菌抗癌的药物中的应用，其包括如下步骤：

34、(1)、将聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸溶解于盐酸盐平衡生理盐水中，将溶液与细菌、癌细胞共培养一段时间，通过染色剂计算细菌及癌细胞存活率；

35、(2)、将溶液通过腹腔注射进入小鼠体内，测量小鼠皮下肿瘤大小随时间变化。

36、优选地，步骤(1)中，细菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌中的一种以上。

37、优选地，步骤(1)中，细胞选自小鼠结肠癌细胞、人肺癌细胞、人黑色素瘤细胞中的一种以上。

38、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

39、第一、本发明通过将赖氨酸重复接枝至ε-聚赖氨酸，即通过ε-聚赖氨酸作为主链具有多个氨基的特点，与赖氨酸活化酯逐代反应，迅速制备了支化度高(每个赖氨酸均连接三个三个赖氨酸)、分子量大(迭代三代后分子量超过30000)、官能团丰富(迭代三代后端氨基超过240个)的超支化梳型聚赖氨酸，制造成本低廉。

40、第二、本发明使用聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸，通过控制投料比，利用其表面丰富的氨基与聚己内酯进行偶联，得到一系列两亲性聚己内酯接枝的超支化梳型聚赖氨酸，步骤简单，适合大规模制造，既提高超支化聚赖氨酸的疏水性，又增强了其生物相容性；另外，聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸可以通过静电作用，吸附于带负电荷的细菌与癌细胞细胞膜表面，实现对细菌与癌细胞的破坏效果。

41、第三、本发明的聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸具有优异的抗菌抗癌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、小鼠结肠癌细胞，人体肺癌细胞、人黑色素瘤细胞均有优异的杀伤效果。聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸通过膜破坏机理这一物理方式实现抗菌抗癌效果，不易诱导细菌与癌细胞产生耐药性。通过腹腔注射的方式，可以抑制小鼠体内肿瘤的生长，因此有潜力替代传统化疗药物应用于临床治疗领域。

42、第四、本发明的聚己内酯修饰的超支化梳型聚赖氨酸具有优异的生物相容性，溶血率低，对体细胞毒性小。