本氏烟NbWhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法

本氏烟nbwhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种本氏烟nbwhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用。


背景技术：

2.双生病毒是世界范围内广泛发生的单链环状dna病毒，包含了520多种，是目前为止种类最多的植物病毒。根据基因组结构、介体种类和寄主范围，双生病毒被划分为14个属，其中危害最大的是菜豆金色花叶病毒属病毒。该属病毒由烟粉虱传播，对番茄和烟草等作物的生产造成了严重损失。目前，双生病毒已在我国广泛分布，危害最严重的两类双生病毒是tylcv病毒和tylccnv/tylccnb病毒，感病植株出现矮化、黄化、茎叶扭曲和卷叶等症状，严重制约了番茄等产业的发展。
3.双生病毒是一类专性寄生物，自身仅编码有限的遗传信息，需要依赖与植物复杂的相互作用才能完成复制、转录、翻译和传播等生活史。培育抗病品种是控制双生病毒最有效的手段，但是自然界中现有的抗性资源有限，且抗性往往仅对少数几种双生病毒有效。例如，抗性基因ty-3能够介导对tylcv病毒的抗性，但是ty-3介导的对tylcv病毒的抗性能够被双生病毒伴随的卫星dna-beta卫星所克服。因此，挖掘双生病毒侵染所需的寄主因子并对其进行改造可以加快抗双生病毒的分子育种工程。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供一种本氏烟nbwhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用。
5.本发明的第二目的是提供一种本氏烟nbwhirly1基因敲除的转基因植物的培育方法。
6.本发明发现了本氏烟nbwhirly1基因是一个双生病毒的感病基因。利用rnai技术，以本氏烟的nbwhirly1基因片段为rnai干扰片段，构建了rnai重组载体。通过农杆菌转化的方法，将nbwhirly1的rnai载体成功导入目的植物中，获得的沉默nbwhirly1的转基因烟草能够显著减轻tylcv病毒和tylccnv/tylccnb病毒的侵染，有效控制该病害的危害。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
8.本氏烟nbwhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用，其中，所述双生病毒为tylcv病毒和/或tylccnv/tylccnb病毒。所述nbwhirly1基因序列如seq id no:19所示。
9.具体的，将nbwhirly1基因片段构建到rnai载体上，获得nbwhirly1 rnai载体；通过农杆菌转化的方法转化目的植物，获得的沉默nbwhirly1的转基因本氏烟能够显著减轻
10.tylcv和tylccnv/tylccnb的侵染；其中，所述nbwhirly1基因片段如seq id no:1所示。
11.一种抗双生病毒的nbwhirly1转基因植物的培育方法：将nbwhirly1基因片段构建
到rnai载体上，获得nbwhirly1 rnai载体，通过农杆菌转化的方法转化目的植物，获得沉默nbwhirly1的转基因本氏烟。其中，所述nbwhirly1基因片段如seq id no:1所示。
12.具体包括以下步骤：
13.1)本氏烟cdna的获得：取本氏烟叶片样品，使用trizol法抽提rna，使用oligo(dt)
18
(5'-tttttttttttttttttt-3')引物反转录获得cdna；
14.2)nbwhirly1序列的克隆：以nbwhirly1基因的第164至424位碱基片段作为rnai的靶标片段，该核酸片段如seq id no:1所示。使用引物对nbwhirly-1f与nbwhirly-1r；nbwhirly-2f与nbwhirly-2r，如seq id no:2-5所示，以本氏烟的cdna为模板进行pcr扩增，得到nbwhirly1-1和nbwhirly1-2片段；
15.nbwhirly1-1f：gagctcgacgacaagacccggggaaacctttccttaacatgccg；
16.nbwhirly1-1r：ataattatttccttaccccgggagacctgctttctaccccaat；
17.nbwhirly1-2f：catttggattgattacagacgcgtagacctgctttctaccccaat；
18.nbwhirly1-2r：ctctagagcacacgacccgtcgacgaaacctttccttaacatgccg；
19.3)nbwhirly1-rnai载体的构建：割胶回收nbwhirly1-1片段，通过in-fusion方法将该片段与smai酶切后的prnai-lic-l载体连接，获得prnai-lic-l-nbwhirly1-1；将nbwhirly1-2片段回收后通过in-fusion方法将该片段与mlui与sali酶切后的prnai-lic-l-nbwhirly1-1载体连接，获得nbwhirly1-rnai。
20.4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500v电击转化，恢复后涂布到含有卡那霉素和利福平的lb固体培养基上，筛选获得带有nbwhirly1-rnai重组质粒的农杆菌；
21.(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染无菌烟草叶盘，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
22.(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，利用trizol抽提rna，并反转录获得cdna；利用引物对nbwhirly1-pcr-f与nbwhirly1-pcr-r以及nbgapdh-pcr-f与nbgapdh-pcr-r，如seq id no:6-7和seq id no:20-21所示，以提取的cdna为模板进行实时荧光定量pcr扩增，筛选获得沉默了nbwhirly1的转基因烟草；
23.nbwhirly1-pcr-f：gtcaggaaggtgttgaaggttg；
24.nbwhirly1-pcr-r：tcttcaggcttgaaggaattcac；
25.nbgapdh-pcr-f：gcagtgaacgacccatttatctc；
26.nbgapdh-pcr-r：aaccttcttggcaccaccct。
27.同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
28.本发明发现了烟草中tylcv和tylccnv/tylccnb的感病基因nbwhirly1，并且通过农杆菌转化的方法，获得了nbwhirly1表达受到rnai抑制的转基因本氏烟，获得的nbwhirly1rnai植株能够显著抑制tylcv和tylccnv/tylccnb的侵染。
29.下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟nbwhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及其转基因植物培育方法作进一步说明。
附图说明
30.图1为nbwhirly1 rnai转基因烟草的表型和沉默情况。a：nbwhirly1-rnai载体示
意图。b：5周龄的野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草(nbwhy1 rnai-1和nbwhy1rnai-2)的表型图。wt代表野生型本氏烟。c：qrt-pcr检测nbwhirly1-rnai转基因烟草的沉默效率。nbgapdh作为本氏烟的内参基因(如seq id no:22所示)。
31.图2为nbwhirly1-rnai转基因烟草增强对tylccnv/tylccnb的抗性。a：tylccnv/tylccnb接种野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草(nbwhy1 rnai-1和nbwhy1 rnai-2)5天、10天和15天后的症状图。b：southern blot检测野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草(nbwhy1 rnai-1和nbwhy1 rnai-2)接种10天后的病毒dna积累量。c：qpcr检测野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草病毒dna积累量。
32.图3为nbwhirly1-rnai转基因烟草增强对tylcv的抗性。a：tylcv接种野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草(nbwhy1 rnai-1和nbwhy1 rnai-2)7天、14天和21天后的症状图。b：southern blot检测野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草(nbwhy1rnai-1和nbwhy1 rnai-2)病毒dna积累量。c：qpcr检测野生型本氏烟和nbwhirly1-rnai转基因烟草的病毒dna积累量。
具体实施方式
33.实施例1nbwhirly1-rnai载体的构建
34.(1)本氏烟cdna的获得
35.本氏烟草叶片取样，使用trizol法抽提rna，使用oligo(dt)
18
(5'-tttttttttttttttttt-3')引物(seq id no:18)反转录获得cdna。
36.具体实验方法为：
37.剪取少量的植物叶片(少于0.1g)，放入含有5mm钢珠的2ml离心管中，扣紧盖子后放入液氮中速冻，用tissuelyser-48多样品组织研磨机以40hz的速度研磨样品，研磨大约60s研磨至粉末状即可。在通风橱中向研磨后的样品中加入1ml trizol提取液，立即用漩涡混合器震荡混匀样品，并在室温放置5min。向离心管中加入300μl氯仿，盖紧盖子后用漩涡混合器立即震荡15s，室温放置2min。随后将离心管放置在4℃离心机中，12000rpm离心15min，吸取上清液于一新的1.5ml离心管中(约500μl)，加入等体积的异丙醇，盖紧盖子后颠倒混匀，室温放置20min。接着将其放入4℃预冷过的离心机中，12000rpm离心15min。弃掉上清液，向离心管中加入1ml 70％的酒精(需用灭菌的depc水配置)以洗涤沉淀，放入4℃预冷过的离心机中，10000rpm离心3min(洗涤沉淀两次)。弃掉上清液将含有沉淀的离心管开盖后在通风橱中放置大约10min至沉淀稍干燥，向其中加入30μl 65℃预热过的depc水，并用移液枪吸打助溶即可。提好的样品经过基因组dna的去除后，使用oligo(dt)
18
(5'-tttttttttttttttttt-3')引物反转录获得cdna。
38.(2)nbwhirly1-rnai的构建
39.选择了nbwhirly1基因(seq id no:19所示)的第164至424位碱基片段作为rnai的靶标片段，该核酸片段如seq id no:1所示。使用引物对nbwhirly-1f与nbwhirly-1r；nbwhirly-2f与nbwhirly-2r，如seq id no:2-5所示，以本氏烟的cdna为模板进行pcr扩增，克隆得到nbwhirly1-1和nbwhirly1-2。
40.nbwhirly1-1f：gagctcgacgacaagacccggggaaacctttccttaacatgccg；
41.nbwhirly1-1r：ataattatttccttaccccgggagacctgctttctaccccaat；
42.nbwhirly1-2f：catttggattgattacagacgcgtagacctgctttctaccccaat；
43.nbwhirly1-2r：ctctagagcacacgacccgtcgacgaaacctttccttaacatgccg；
44.pcr扩增体系为：15μl ddh2o、5μl 5
×
transstart fastpfu buffer、0.5μl 5’端引物(10μmol/l)、2μl 2.5mm dntps、0.5μl 3’端引物(10μmol/l)、1μl transstart fastpfu dna polymerase、1μl模板，最终总体积为25μl。
45.反应参数为：95℃预变性2min后进行循环反应：95℃变性20s、50℃退火20s、72℃延伸2kb/min，循环35次后，72℃延伸10min。扩增后的pcr产物纯化测序后为nbwhirly1基因片段。将nbwhirly1-1片段回收后，通过in-fusion克隆方法将该片段与smai酶切后的prnai-lic-l载体连接，获得prnai-lic-l-nbwhirly1-1；将nbwhirly1-2片段回收后通过in-fusion克隆载体构建方法将该片段与mlui与sali酶切后的prnai-lic-l-nbwhirly1-1载体连接，获得nbwhirly1-rnai载体。如图1a所示。
46.实施例2nbwhirly1-rnai转基因烟草的培育和抗病性检测
47.(1)nbwhirly1-rnai转基因烟草的培育
48.将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500v电击转化，恢复后涂布到含卡那霉素和利福平抗性的固体培养基上，筛选获得带有rnai-nbwhirly1重组质粒的农杆菌；将带有重组质粒的农杆菌侵染无菌烟草叶盘，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗。待继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用trizol法抽提rna，并反转录获得cdna。利用引物对nbwhirly1-pcr-f与nbwhirly1-pcr-r以及nbgapdh-pcr-f与nbgapdh-pcr-r，如seq id no:6-7和seq idno:21-22所示，以提取的cdna为模板进行实时荧光定量pcr扩增，筛选沉默了nbwhirly1的转基因烟草，如图1b和c所示。
49.nbwhirly1-pcr-f：gtcaggaaggtgttgaaggttg；
50.nbwhirly1-pcr-r：tcttcaggcttgaaggaattcac；
51.nbgapdh-pcr-f：gcagtgaacgacccatttatctc；
52.nbgapdh-pcr-r：aaccttcttggcaccaccct。
53.(2)nbwhirly1-rnai转基因烟草抗病性检测
54.播种野生型本氏烟及rnai-nbwhirly1转基因植物株系line 1、line 2。生长4周后，分别接种tylccnv/tylccnb和tylcv。分别在接种10天和14天后观察病毒症状，并提取系统叶dna，利用引物对tylccnv-southern-f、tylccnv-southern-r、tylccnb-southern-f、tylccnb-southern-r、tylcv-southern-f和tylcv-southern-r，如seq idno:8-13所示，进行southern blot检测病毒的积累量。同时，利用引物对tylccnv-qpcr-f、tylccnv-qpcr-r、tylcv-qpcr-f和tylcv-qpcr-r，如seq id no:14-17所示，进行qpcr检测系统叶病毒积累量。
55.tylccnv-southern-f：gaacttcgacagcccatacatggg；
56.tylccnv-southern-r：gcgatcttcgtcaccctccaacag；
57.tylccnb-southern-f：gtagaaaccactacgctacgcagcagcc；
58.tylccnb-southern-r：agtggtttctaccctcccaggggtacac；
59.tylcv-southern-f：acgtacaggcccatgtaccgga；
60.tylcv-southern-r：actgctcctcaagcagagaatggc；
61.tylccnv-qpcr-f:gtaacggatgttacccgtgg；
62.tylccnv-qpcr-r:gtccgccagtaaccgtagaa；
63.tylcv-qpcr-f：ggatttcgttgtatgttagc；
64.tylcv-qpcr-r:atgattatatcgcctggtc；
65.实验结果如图2和图3所示，可以看出，相对于野生型本氏烟，nbwhirly1-rnai转基因植物两个株系接种病毒后所产生的病毒症状更轻。
66.通过以上实验结果表明：通过农杆菌转化的方法获得的nbwhirly1表达受到rnai抑制的转基因本氏烟能够显著抑制tylcv和tylccnv/tylccnb的侵染。
67.以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。