专利名称:活细胞标记的制作方法
本项发明涉及标记活细胞而对细胞的形态或功能没有不利影响的新方法。
荧光检测方法作为测定许多细胞特殊性质的分析手段，广泛应用于免疫学和细胞生物学的各个方面。荧光检测的优点是，单个染料分子能够在每秒钟里几千次地被激发并返回基态，发射出许多光子。因此，如果一个单个抗体分子用两个或三个染料分子标记，就能从一个单个的抗原一抗体结合位点获得几千个光子。这是一项很可观的信号增强技术。
二氧杂羰花青染料已被用来进行白血细胞分类测定。Gunter Valet，MaX Planck Ges Wissensch;专利登记号84-102307/17，通过同时进行选择性染色、体积和荧光测定对血细胞的定量测定。可是，在这些研究中运用的染料是短链羰花青染料(少于10个碳)，并且对膜电位的变化有反应。此外，这些短链羰花青染料进入细胞线粒体，是毒害细胞的，而且当洗涤细胞时，不论细胞膜电位是否变化，染料都容易渗出细胞。本项发明的长链染料被封闭在细胞膜里，并且只受到膜电位非常小的影响。它们不渗出细胞。
用于进行白血细胞鉴别的其它类型的染料不是花青类的，而且不嵌隔到脂质里。吡喃鎓(Pyrilium)或噻喃鎓(thiapyrili-nm)化合物已经被用来区分白血细胞种类(David S.Frank，R.T.Belly，专利登记号84-166275/27，《用吡喃鎓或噻喃鎓化合物染色来鉴别生物样品中的细胞》)。可是，这些染料是结合到细胞的胞质或细胞核成分上的，它们不是特异地结合到细胞膜上。其它阳离子染料(L.Kass，专利登记号81-78187/43，《用异染性阳离子染料染色确定不同白细胞的类别》，L.kass，美国专利号4，400，370，1983年8月23日，《用于白细胞分类确定的异染染料吸附方法》，L.kass，专利登记号83-771982/39，《用特定碱性染料染色不固定细胞分析人的血细胞》)已经被用来进行白血细胞的鉴别，然而，这些染料不能有效地嵌隔在膜的脂质里，而是着染细胞内的各种细胞器。另一种用来进行白血细胞鉴别的异染性染料是吖啶橙(P.J.Natale，美国专利号4，336，029，1982年6月22日，《用于全血中网织红细胞和血小板定量测定的方法和试剂》，R.J.Gershman，美国专利号4，325，706，1982年4月20日，全血中血小板和网织红细胞的自动检测。吖啶橙能染色细胞的RNA和DNA，而不能有效地嵌隔在膜的脂质里。
另外一项应用是利用部花青540来区分正常细胞和恶性细胞。这种染料有一个长烃链尾巴，最长有15个碳，可这个分子在烃链尾巴末端有一个亲水基团，并且当细胞受光照时染料是毒害细胞的。Valinsky，J.E.，Reich，E.and Easton，T.G.，美国专利号4，424，201，1984年1月3日，《运用部花青染料检测恶性白细胞》。部花青特异地掺入到正常和恶性细胞的细胞膜中。
短链脂肪族花青染料被用在许多生物学分析上。可是，这些短脂肪链分子对膜电位有反应，并能跨过细胞膜，穿透到细胞的线粒体内。H.M.Shapiro，美国专利号4，343，782，1982年8月10日。这些短链花青染料也是毒害细胞的，并且因为它们迅速地从细胞中渗出来，所以不能用在活体内示综细胞。
三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，Proc.Mayo Clinic 32478-484，1957)和伊文思蓝(Evans-blue)染料(Schad，H.，et al，Pfluegers Arch Eur J.Physiol 370(2)139-144，1977)已经用来在活体内通过一种稀释方法测定心输出量。道尔(Dow)(Dow，P.，Physiol.ReV.3677-102，1956)把这种方法描述为，把已知量的某种血管内指示剂注射到肺的静脉侧，然后测定这种指示剂在动脉中的浓度随时间变化的过程，以确定注射点和取样点之间的体积。这些染料不能用来染色细胞。
荧光素和若丹明染料的长链脂肪族衍生物已被用来监测细胞融合(Wanda，P.E.and Smith，J.D.，J.Histochem.CytoChem 301297-1300，1982)。可是，这些染料只含有一种脂肪族碳链，而且长时间在膜里是不稳定的。并且，异核体形成的检测方法是根据两个染料分子之间的共振能量转移。此外，染色是在盐水中进行的，尚不了解其溶解性。
生物物理学家已经利用长链型的双脂肪族花青染料的主要用途来研究细胞膜的流动性(D.Axelrod，Biophysical J.，26557-574，1979)。在这些类型的研究中，染料是从一种乙醇原液被用到短期培养的细胞上的。据几名研究人员报导，染色过程中变化很大。可是对于生物物理测定来说，有必要在每个被研究的细胞都被测定几次的地方，只考查几个细胞。结合到质膜上去的长链羰花青染料也已经用来测定培养神经元的原始同一性。Honig，M.G.and Hume，R.I.，J.Cell Biology 103171-187(1986)。一种对细胞的形态或功能没有不利影响而同样染色活细胞的方法是上述参考文献中所没有的。
本发明是可对活细胞进行牢固而可重复的标记的新方法，对细胞的形态或功能没有明显的改变。根据本发明，细胞用一种具有足够脂溶性和足够高的细胞膜分配系数的花青染料进行标记，以便最大限度地减少或防止染料分子从细胞膜中流出。把染料加到悬浮在含有一种渗透压调节剂的介质里的细胞中，能达到坚固的、可重复的标记，这种渗透压调节试剂对细胞生活力没有明显影响而且染料能够在其中溶解。这样的渗透压调节试剂包括糖、糖醇、氨基酸和某些氢离子缓冲剂(“Good氏缓冲剂“)。
本发明方法用于标记各种细胞而对细胞的形态或功能没有不利影响，本方法中使用花青染料。具有下列结构的化合物在这里被称作花青染料
其中Y是氧，硫，亚甲基或被烷基取代的亚甲基;
m是0-3;
n是12-22。
这里所用的被烷基取代的亚甲基是指具有甲基、乙基或丙基取代基的任何组合的单或双取代亚甲基。
具有上述结构的化合物用下述通用的速记公式表示DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem.，133315(1974)。举例来讲也就是说，其中的Y是硫，并具有3个碳原子来连接环，还有2个14碳脂肪链的化合物记作DiSC14(3)。相似地，DiIC14(5)表示其中的Y是异丙基，有5个碳原子来连接环以及2个14碳脂肪链的该化合物。
具有上述结构、有一个或多个取代的化合物包括在这里被称作花青染料的化合物中，假定这样的取代化合物至少在标记所需要的时间里可以溶解在细胞标记介质中，而且具有足够高的细胞膜分配系数以保持与被标记的细胞膜结合。这样的化合物还必须在标记所需的浓度下对细胞的生活力没有明显影响。染料在细胞标记介质里的溶解性是按照下述的方法测定的，把一种花青染料分散到标记介质中，用一般荧光分光光度技术测定细胞的荧光强度随时间的变化。荧光强度下降表明染料沉淀并附着到容器壁上。例如，使用已知的流动式血细胞计数方法，来监测标记后重新注射到供血动物中的红血细胞的荧光强度，以确定染料是否仍然与细胞膜结合。重新注射后，标记细胞的荧光强度基本不变，证实了染料在细胞膜中的溶解性。
掺入一个可用核磁共振成象检测的原子的上述结构的化合物也包括在这里被称作花青染料的化合物中。这样的化合物可以通过比如把一个氟原子掺入脂肪链的甲基基团之一来制备。用象125I这样一个伽马放射物标记的上述结构的化合物，在这里也被称作花青染料。
本发明所使用的花青染料可以从多处购买到，象Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，而且能够用已知的合成方法从现有的起始原料制备。Hamer，F.M.，The Cyanine Dyes and Related Compounds，Interscience Publishers(1964)。
使用本发明的方法，任何活细胞都能用花青染料标记。这里所用的“细胞”这个术语，包括原核细胞，如细菌，具核的真核细胞如白血细胞、各种肿瘤细胞和培养的哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢细胞，酵母，还包括无核细胞如红血细胞和血小板。如果一个有核的细胞能够生长，或者能基本上象它所属类型细胞那样行使功能，细胞就是活的;一个不具核的细胞如果能够行使它预期的功能就是活的，例如，一个活的红细胞能够运输氧和二氧化碳;活的血小板能够在如聚集和释放分析中基本上表现其应有的行为。
细胞标记在一种不会使细胞致死的介质中进行，该介质能提供可重复的细胞标记。要使这种介质具有这些必要特征，得使用渗透压调节剂，花青染料至少可以在标记所需要的同样长的时间里在这种试剂中形成稳定的溶液。合适的渗透压调节剂包括这样的试剂或试剂组合，如糖，例如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖等单糖和蔗糖等双糖，糖醇，如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇及阿东糖醇，氨基酸，如甘氨酸和精氨酸，以及某些Good氏缓冲剂，如N-三(羟甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸以及下面列在表Ⅱ中的那些化合物。Good，N.E.，et al，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，Feguson，W.J.，etal.，Anal.Biochem.104301-310(1980)。然而，有些细胞系可能对其中一种或多种渗透压调节剂敏感，特别是对糖醇。因此，标记以前要进行标准检验，以肯定细胞在所要用的渗透压调节剂中是能够生存的。此外，可在标记介质中加入少量缓冲剂来调节氢离子浓度。
与各种渗透压调节剂接触对细胞生活力的影响，是通过测定Yac细胞在接触各种渗透压调节剂30分钟后细胞的倍增时间来确定的。Yac细胞是可以从American Type Culture Collec-tion公开得到的一种小鼠淋巴瘤组织培养细胞系，由Kiessl-ing，R.，European J.Immunology 5112-117(1975)描述。正如表Ⅰ列出的数据所表明的，与磷酸盐缓冲液相比，与蔗糖、葡萄糖和Good氏缓冲液TAPS，CAPS，EPPS，HEPPSO和DIPSO接触，对细胞倍增时间产生可忽略的影响，说明不存在与接触有关的细胞毒性。
表Ⅰ渗透压调节剂 倍增时间(小时)磷酸盐缓冲盐溶液 31.0蔗糖 41.0葡萄糖 34.5TAPS 32.5CAPS 45.8EPPS 32.2HEPPSO 23.4DIPSO 36.73-氨基-1-丙磺酸 99.63-(N-吗啉代)丙磺酸钠(MOPS) A2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 B2-氨基-2-甲基-1-丙醇 BN-三(羟甲基)甲氨基乙磺酸(TES) BN，N-双(2-羟乙基)-2-氨基 A乙磺酸(BES)3-(环己氨基)-2-羟基 A-1-丙磺酸(CAPSO)三乙醇胺 B三(羟甲基)氨基甲烷(TRIZMA) B
表Ⅰ(续)渗透压调节剂 倍增时间(小时)Bis-tris丙烷 B2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES) B3-〔二甲基(羟甲基)甲氨基〕-2- A羟基丙磺酸(AMPSO)N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸 57.7(BICINE)3-〔(-3-胆酰胺丙基)二甲基铵〕 B-1-丙磺酸盐(CHAPS)3-〔N-三(羟甲基)甲氨基〕-2- 63.6羟基丙磺酸(TAPSO)3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸 178.4(MOPSO)2-〔(2-氨基-2-氧乙基)氨基〕 1038.4乙磺酸(ACES)双(2-羟乙基)亚氨基-三-(羟甲基) A甲烷(BIS-TRIS)2-(N-环己氨基)乙磺酸(CHES) 51.5N-三-(羟甲基)甲基甘氨酸 A(TRICINE)葡糖胺 288.4咪唑 B甘氨酰甘氨酸 66.9A-不生长或部分细胞毒性B-剧烈细胞毒性表Ⅱ给出用于检查花青染料溶解性的各种渗透压调节剂。所有浓度的测定都是通过离心除去沉淀后，把含有花青染料的渗透压调节剂的小等分样品溶解到乙醇里进行荧光分光光度分析而进行的。所用的染料是DiSC14(5)和DiOC14(3)，渗透压调节剂处在等渗浓度。以乙醇溶液作标准，荧光强度的下降与花青染料溶解性的降低直接相关。
表Ⅱ相对荧光强度(CONC)渗透压调节剂 DiSC14(5) DiOC14(3)乙醇 100 100葡萄糖 31 100果糖 35 100山梨糖 40 100蔗糖 41 100木糖 36 19-52核糖 24 100来苏糖 0.12 1.8甘氨酸 31 93精氨酸 17 17.2甘油 39 99.5肌醇 42 92木糖醇 34 76.4甘露醇 29 ＊阿东糖醇 34 ND
表Ⅱ(续)相对荧光强度(CONC)渗透压调节剂 DiSC14(5) DiOC14(3)三(羟甲基)-甲氨基丙磺酸(TAPS) 18 ND3-(环己氨基)-1-丙磺酸(CAPS) 40 NDN-(2-羟乙基)哌嗪-N′-3- 18 ND丙磺酸(EPPS)N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-羟基 20 ND丙磺酸(HEPPSO)3-〔N-N-双(2-羟乙基)氨基〕 43＊＊＊ND-2-羟基丙磺酸(DIPSO)NaCl 6 1.7磷酸盐缓冲盐溶液 2.1 6.5Na2SO47.4 1.6Nal 1.1 0.14氯化胆碱 11＊＊6.3碘化胆碱 0.16 2.3＊在乙醇里沉淀，没有得到数据。
＊＊由不能形成沉淀的大晶体造成的假象。
＊＊＊在酒精里沉淀(数据有问题)。
ND未测。
从表Ⅱ可以看出，花青染料在一般盐存在时，比在除来苏糖以外的糖、糖醇、氨基酸和Good氏缓冲剂TAPS、HEPPSO、DIPSO、CAPS和EPPS存在时溶解度小得多。此外，测定了DiSC14(5)溶液在下列物质中的稳定性糖类如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖、蔗糖和木糖，糖醇如甘油、肌醇、木糖醇和阿东糖醇，氨基酸如甘氨酸和精氨酸。花青染料在所检测的溶液中至少可以稳定存在20分钟，这足够用来进行可重复的细胞标记。而且这些试剂中有许多都发现花青染料在其溶液中的量到60分钟时还没有明显减少。
进一步，测定花青染料在一种含有一般盐和可溶解染料的渗透性调节剂的介质中的溶解度。DiSC14(5)在等渗葡萄糖溶液中的溶解度不因用蒸馏水稀释而受明显影响。可是，DiSC14(5)在等渗的葡萄糖溶液中的溶解度却因用仅约20%的等渗氯化钠溶液稀释而明显降低。因此，使用花青染料进行的可重复的细胞标记，只能在含有少量一般盐的介质中进行，这些盐如氯化钠，氯化钾，氯化钙，醋酸钠，醋酸钾，硫酸钠，碘化钠，氯化胆碱或者碘化胆碱;而且，最好在没有用任何一般盐来调节渗透压的介质中进行标记。
为了确定标记对细胞生活力的影响，分析利用本发明方法用花青染料标记的细胞。V79细胞可从American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，并在Prescott，D.M.，Ann.New York ACad.Sci.，397101-109(1982)中描述;把V79细胞用含有浓度为10-5或4×10-5M的DiOC14(3)溶液进行标记，并比较被染色的细胞与未经染色的细胞以及染色细胞与未染色细胞的等量混合物的生长动力学。经过花青染料标记，细胞的倍增时间没有受到影响，因此，标记对细胞生长没有任何影响。台盼蓝排除法和Propidinm iodide排除法这样几种其它的细胞生活力常规检测法也确证，按所描述的方法进行花青染料标记对细胞生活力没有影响。
花青染料标记对细胞生活力的影响还可以通过测定红细胞的脆性加以确定。标记的和未标记的红血细胞悬浮在由于改变盐浓度而具有可变渗透强度的氯化钠介质中，细胞的体积分布用带有一个通道附件的库尔特(Coulter)计数仪来测量，测出平均体积并对每一盐浓度作图。氯化钠浓度下降时，细胞体积增加，直到氯化钠浓度大约为0.5g/100ml时，细胞体积出现一个急剧下降，在这一点上红细胞裂解。而且不论细胞是否经过花青染料标记，细胞体积变化都是一样的。
类似地，在平行样品中把溶血作用作为氯化钠浓度的函数来监测。红细胞放入氯化钠中大约2-3分钟后，溶液离心沉淀所有未裂解的细胞。然后对上清液进行分光光度分析，测定血红蛋白浓度。细胞裂解的百分比通过每个样品的血红蛋白浓度与全部裂解的对照样品相比较来确定。直到氯化钠浓度达到大约每100ml0.5g时，游离血红蛋白浓度是相对较低的，此后，血红蛋白迅速释放。通过与红细胞脆性实验的结果进行比较，细胞体积变化与血红蛋白释放直接相关。此外，血红蛋白的释放在标记细胞和未标记细胞中是相同的。
为了检验按照本发明的方法用花青染料标记的细胞在活体内的稳定性，取兔红细胞用DiSC14(5)标记并回输。此后定期取血样，并分析标记细胞的百分比和标记细胞荧光强度。循环的红细胞数量作为时间的函数而呈线性减少，而且测得的标记细胞的52天的寿命与报导过的兔红细胞40天到60天的平均寿命非常接近。因此，花青染料标记不影响红血细胞的清除速率。
在所检验的5只兔子中，除1只以外，其余所有兔子的染色细胞的荧光强度在标记并重新注射60天后基本保持不变。在第5只动物中，只有不超过20%的花青染料在兔子体内循环60天以后从标记细胞中流出来。结合从组织培养得到的表明染料不会从标记细胞向未标记细胞转移的资料，这些数据说明细胞被染料稳定标记。
根据本发明用花青染料标记的活细胞，用于许多要求能区分一个细胞群体中的多个亚群体的应用中。比如，要确定输入红血细胞后血细胞比容的减少是因为流血引起，还是由于对被输入的细胞发生免疫反应引起，可在输血以前，取一个等分的细胞试样，按照本发明的方法进行标记，并且在输血后立即测定循环中的被标记的红细胞组分。此后，如发现血细胞比容下降，就把标记细胞组分与输血刚结束时的标记细胞组分进行比较，并且算出标记细胞和未标记细胞血细胞比容减少的相对速率。标记细胞和未标记细胞血细胞比容减少量相同，表明由流血造成的失血;而标记细胞血细胞比容下降较多，则说明对输入细胞产生免疫反应。用类似的方法，可以区分由于流血造成的输入血小板后血小板计数的减少和对输入血小板的免疫反应。
本发明的方法也用来测定培养的哺乳动物细胞的生长速率。被标记的培养细胞每分裂一次，花青染料就平均分布到两个子细胞上。因此，使用流动血细胞计数技术来比较生长一定阶段后的细胞的荧光强度和标记后立即测定的荧光强度，就可以确定细胞分裂的次数，因而可以测定细胞生长速率。
下面的实施例阐述本发明，但并非限制如上限定的及如下要求的本发明的范围。
实施例1组织培养细胞的染色方法
Ⅰ、细胞的制备使用生长对数期的组织培养细胞以得到最佳结果。从培养容器中取出悬浮培养物并放入聚丙烯离心管。
使用单层培养时，必须除去上清液，用无钙镁离子的磷酸盐缓冲液洗涤附着的细胞，从培养瓶中除去血清蛋白。加入胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco laboratories，Grand Island，New York，＃ 610-5300)，没过瓶底，置室温下培养，直到细胞单层松动并解聚。将得到的细胞悬浮物转移到一个聚丙烯离心管中，加入等体积的含10%小牛血清(FBS)(Hazelton)的培养介质来阻止胰酶的酶作用。把细胞在室温下以400×g离心10分钟。吸出上清液，代之以等体积的等渗甘露醇来重新悬浮细胞沉淀物。这一步甘露醇洗涤是为了除去细胞悬浮液中的血浆蛋白并制备用于染色的细胞。把细胞再一次在室温下以400×g离心10分钟，吸出上清液，得到的细胞沉淀物以2×106细胞/ml的浓度重新悬浮在甘露醇溶液中以便染色。但有些细胞系对糖醇(甘露醇)的使用敏感，在这样的情况下，可以使用等渗的葡萄糖溶液(MW 180.16，54.05g/l)。
Ⅱ、染料原液的配制在无水乙醇中配制2×10-3M原液如下DiO-C14(3) MW800(1.600mg/ml)DiS-C14(5) MW814(1.628mg/ml)DiO-C18(3) MW936(1.872mg/ml)DiI-C14(5) MW850(1.700mg/ml)所有染料都是从Molecular Probes，Eugene，Oregon得到的。
染料原液要用声处理以保证染料完全溶解，并且使管壁上的吸附减到最少。原液配制使用聚苯乙烯管以可观察到染料的溶解。但是，因为花青染料在水溶液环境里，对聚丙烯的吸附比对聚苯乙烯的吸附要少得多，所以染色细胞用聚丙烯管。
Ⅲ、细胞染色在等渗的甘露醇溶液中把细胞浓度调整到2×106细胞/ml。为染色细胞，把2×10-3M的染料原液按照每1ml细胞悬浮液加入5ul染料加到染色溶液中。吹吸或者搅拌用于染色的样品，使样品完全混合。把细胞与染料一起保温10分钟，然后取出一小份样品用于在荧光显微镜下检查，以保证已产生强烈而均匀的染色。DiO染料系列使用对488微米激发光具有选择性的显微镜滤波器，而DiS和DiI染料系列要求在575nm附近激发进行荧光观察。
保温期后，向染色细胞悬浮液中加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。细胞在20℃以400×g离心10分钟。吸出上清液，并把沉淀物重新悬浮在PBS中。重复离心过程，用得到的上清液观察染料是否存在。如果染料在上清液中显而易见，则重复洗涤直到用荧光分光度计测量时上清液里没有游离的染料为止。在最后一次洗涤后，除去上清液，把沉淀物按照所要求的浓度重新悬浮在合适的培养介质中。所有步骤均在无菌条件下进行。
实施例2红血细胞染色Ⅰ、试剂配制A、柠檬酸盐抗凝剂1.66g 柠檬酸钠
0.206g 柠檬酸0.140g NaH2PO41.61g 葡萄糖列出的组分溶解在63ml蒸馏水中，并把溶液的PH调到5.6。配成的终溶液经过一个0.22微米的滤器灭菌。
B、等渗葡萄糖溶液葡萄糖(54.05g)溶解在1升蒸馏水中。用一个Fiske渗透压计来检查渗透压，如果需要，将渗透压调到320mOsm。
Ⅱ、染料原液的配制在无水乙醇中溶解1.628mg/ml染料制备2×10-3M的DiIC14(5)原液。为了完全溶解染料可能要求声处理。
Ⅲ、染色过程用含有柠檬酸钠的抽血管或者一支含有其总容积1/10量的所配制的柠檬酸盐抗凝剂的注射器，无菌收集全血。保存一小份样品用于流动血细胞计数或功能检测。血液在室温下以100×g离心10分钟以使红细胞沉淀。把含有血小板的血浆移走并保存起来，而用与压紧的红细胞沉淀的5倍体积相等量的等渗葡萄糖液洗涤红细胞。细胞应在室温下以100×g再次离心10分钟，吸出上清液。这种洗涤能除去血浆蛋白并能得到更强、更均匀的染色，重复洗涤一次以上。最后一次离心并吸出上清液后，把红细胞按照4×108细胞/ml的浓度重新悬浮在等渗葡萄糖中。
加入染料以前，吹吸或搅拌样品以保证没有沉降出现。每1毫升的红细胞悬浮液加入15微升DiSC14(5)(在乙醇中浓度2mM)原液，立即混匀样品，保证染料在溶液里迅速而均匀地散布。大约5分钟后，取出一小份样品进行显微镜观察。用蜡笔在显微镜的载玻片上画一个圈，将染色液中的少量细胞样品放到蜡圈内，在载玻片上放一张盖玻片并观察样品。画蜡圈是为了减少由载玻片和盖片造成的盘状细胞一棘细胞的变形。使用塑料载片和盖片也能防止这类变形。这种方法能在保证产生强烈而均匀的染色的同时，保证在整个染色过程中红细胞结构保持不变。5分钟后细胞应被均匀染色，不需要长于10分钟的接触时间。
在确定细胞已被均匀染色以后，向染色悬浮液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，细胞在室温下以400×g离心10分钟，除去上清液。离心后通常可在上清液中看到有游离的染料残迹存在，因此必须用含有钙镁的磷酸盐缓冲液进行反复洗涤，直到用荧光分光光度计检测时在上清液里没有游离的染料存在。
到这一步，细胞可以悬浮在合适的溶液中用于实验，也可悬浮在不含血小板的血浆中，用于重新注射到受体动物中。重新注射使用的一般方法是，把染色的红细胞重新悬浮在从所收集的全血第一次离心后回收的血浆中和已在400×g下离心除去了血小板的血浆中。所有步骤均使用无菌技术进行。
实施例3血小板染色Ⅰ、细胞的准备收集全血，使用含有柠檬酸钠的抽血管，或者使用含有其总容积1/10量的所配制的柠檬酸钠抗凝剂的注射器。将细胞在室温下以100×g离心10分钟，得到富含血小板的血浆。涉及到血小板的所有步骤都使用塑料吸管和聚丙烯离心管以防止血小板激活。
将富含血小板的血浆吸出并转移到另一支离心管中。接着经过在20℃以100×g离心10分钟把血小板从血浆中沉淀出来。然后把血浆收集并保存起来，或者用于功能检测，或者用作重新注射用的悬浮介质。在用作重新悬浮介质前，这种血浆应该以4000×g离心10分钟，以保证除去任何残留的血小板，把这样的血浆称作无血小板血浆(PPP)。
由1000×g离心得到的血小板沉淀物应小心地重新悬浮在少量体积的柠檬酸盐抗凝剂中，以得到浓缩的均匀悬浮液。这一步操作完成之后，就可以把等渗葡萄糖作为稀释剂按照与最初的血浆相等的量加入。然后将血小板以300×g离心5分钟，吸去上清液。这步葡萄糖洗涤能除去残留的血浆蛋白，并使染色均匀而更强烈。血小板沉淀物重新悬浮在葡萄糖溶液中，现在准备染色。
把血小板浓度调到4×108个细胞/ml，每ml血小板悬浮液加入15微升DiOC14(3)原液(在无水乙醇中浓度为2mM)，立即将悬浮液小心地彻底地混匀，以保证染料的均匀分布。用荧光显微镜观察血小板，保证出现均匀的染色，如果是这样的话，现在就准备把悬浮液中的血小板与游离染料分离开来。
Ⅱ、用于分离标记血小板的Sephadex G-100层析柱的使用人们习惯用Sepharose 2B从富含血小板的血浆中分离血小板。我们已经发现Sephadex G-100也能很好地进行血小板分离。这个技术与染色技术一起运用并按下述方式进行。把血小板-染料悬浮液上柱，小分子量的染料分子截留在凝胶颗粒中，而大的血小板直接穿过层析柱。Sephadex G-100可以这种方式用于分离荧光标记的血小板和悬浮液中的游离染料。
A、层析柱的准备G-100(Pharmacia Laboratories，Piscataway，New Jersey)按厂商的指导进行水化，并在丙酮(100%)中洗涤，为用作血小板分离介质做准备。洗涤过程通过在室温下以300×g离心Sephadex 10分钟来进行，除去上清液，把沉淀重新悬浮在Hanks平衡盐溶液中。应该用Hanks平衡盐溶液反复洗涤，直到再也检测不到丙酮的气味为止。将得到的溶液插入到一个真空沸水浴中进行除气。
这时，用Sephadex浆灌柱，用一个没有抽塞的10CC注射器作为层析柱的支持物。把硅酮管连接到注射器针头插孔上，用一个可调的小管夹来调节经过层析柱的液体流速。用47微米的尼龙筛网在注射器底部作为支持膜，以挡住颗粒。应避免使用带有烧结玻璃滤膜支持物的常规玻璃层析柱，因为这些柱可能激活血小板。将层析柱注满Hanks液，并把少量Sephadex浆加到柱子里。管夹充分打开，使液流缓慢而连续。这一操作能平稳而均匀地压紧Sephadex，防止形成孔道或空气间隙。重复进行加HBSS和Sephadex浆的操作，直到获得所需体积的压紧的柱子。层析柱使用前要用HBSS(2倍外水体积)彻底冲洗。
B、血小板的分离把血小板染料和悬浮液小心地铺到Sephadex上。柱子底部的管夹应该打开，并应使液体在层析柱中的液面下降到刚好抵达Sephadex流体的顶部。继续流动，使悬浮液穿过Sephadex。当液面达到Sephadex顶部时再停止液体流动。小心地向层析柱顶部加入足够量的HBSS，形成一个缓冲带，这样可以很容易再追加HBSS，而不会影响到Sephadex。重新开始层析柱液体的流动。用这个办法能使血小板悬浮液在凝胶中形成一个致密的带，并且能以一个相当均匀的速率流过整个柱长。用这个方法可以得到一个较浓缩的血小板洗脱液。继续经过层析柱的液体流动，收集0.5-1.0ml的各组分。含有血小板的组分可由其混浊度看出，可把这些组分合并到一起，然后把合在一起的组分以300×g离心10分钟。吸出上清液，可以把沉淀物重新悬浮在合适的介质中用于实验或分析，或者重新悬浮在不含血小板的血浆中用于功能测定或重新注射。
本发明较好的实施例阐述如上，但本发明不限于此处公开的说明，而且保留在下面的权利要求
书范围之内的所有改动的权利。
权利要求
1.一种用花青染料标记活细胞的方法，包括在含有一种渗透压调节剂的介质中使细胞与花青染料接触，这种渗透压调节剂对细胞的生活力不造成明显影响而且能提供可重复的细胞标记。
2.根据权利要求
1的方法，其中的渗透压调节剂是一种糖，一种糖醇，一种氨基酸，或者一种Good氏缓冲液或其组合。
3.根据权利要求
2的方法，其中的介质是等渗的。
4.根据权利要求
3的方法，其中的细胞是红血细胞。
5.根据权利要求
3的方法，其中的细胞是白血细胞。
6.根据权利要求
3的方法，其中的细胞是血小板。
7.根据权利要求
3的方法，其中的渗透压调节剂是一种糖。
8.根据权利要求
7的方法，其中的糖是葡萄糖。
9.根据权利要求
3的方法，其中的渗透压调节剂是一种糖醇。
10.根据权利要求
9的方法，其中的糖醇是甘露醇。
11.根据权利要求
3的方法，其中的渗透压调节剂是一种氨基酸。
12.根据权利要求
11的方法，其中的氨基酸是甘氨酸。
13.根据权利要求
3的方法，其中的渗透压调节剂是一种Good氏缓冲剂。
14.根据权利要求
13的方法，其中的Good氏缓冲剂是HEPPSO。
15.根据权利要求
13的方法，其中的Good氏缓冲剂是EPPS。
16.根据权利要求
13的方法，其中的Good氏缓冲剂是TAPS。
17.根据权利要求
13的方法，其中的Good氏缓冲剂是CAPS。
18.根据权利要求
13的方法，其中的Good氏缓冲剂是DIPSO。
19.根据权利要求
3的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)。
20.根据权利要求
3的方法，其中的花青染料是DiOC14(3)。
21.一种物质成份，包括溶解于一种渗透压调节剂的花青染料，该渗透压调节剂对细胞生活力没有明显影响。
22.根据权利要求
21的一种物质成分，其中的渗透压调节剂是一种糖，一种糖醇，一种氨基酸，或者一种Good氏缓冲剂或它们的一种组合。
23.根据权利要求
22的一种物质成份，其中的糖是葡萄糖。
24.根据权利要求
22的一种物质成份，其中的糖醇是甘露醇。
25.根据权利要求
22的一种物质成份，其中的氨基酸是甘氨酸。
26.根据权利要求
22的一种物质成份，其中的Good氏缓冲剂是HEPPSO，EPPS，TAPS，CAPS或DIPSO。
27.根据权利要求
22的一种物质成份，其中的花青染料是DISC14(5)或DIOC14(3)。
28.根据权利要求
3的方法，其中的细胞是一种组织培养细胞。
专利摘要
用对细胞生活力没有明显影响的花青染料进行可重复的活细胞标记的方法。标记细胞的应用包括利用标记的红血细胞区别输血后出血和免疫反应，以及用稀释法测定培养细胞的生长率。
文档编号G01N33/50GK87107216SQ87107216
公开日1988年5月11日 申请日期1987年10月30日
发明者保罗·卡尔·霍兰, 布鲁·戴维·詹森, 休·埃伦·斯莱扎克 申请人:史密丝克莱恩贝克曼公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan