一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法

1.本发明涉及食品毒素残留检测技术领域，具体涉及一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法。


背景技术：

2.薏苡仁为禾本科植物薏苡coixlacryma-jobi l.var.ma-yuen(roman.)stapf的干燥成熟种仁，药性平和，有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结之功，《神农本草经》和《本草纲目》均将其列为上品。药食两用的薏苡仁营养及药用价值均较高，近年来食用人群和用量有所增加。薏苡仁在生长、采集、储藏以及加工过程中易被真菌毒素污染，其中玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)检出频率较高。zen又称“f-2毒素”，是由黄色镰刀菌(f.culmorum)、禾谷镰刀菌(f.graminearum)、三线镰刀菌(f.tricinctum)等真菌产生的有毒代谢产物，主要存在于谷物中，接触或摄入zen会对机体生殖发育、消化系统等造成极大危害，具有潜在的“三致”作用。在《中国药典》(2020年版)中，明确规定了薏苡仁中zen的限量要求，每1000g薏苡仁含zen不得过500μg。
3.中国药典2351真菌毒素测定法中zen检测方法为液相色谱法(lc)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms)，虽然这些方法可以精确地定性、定量分析，但其检测成本高、周期长，无法满足现场大批量样本快速筛查的需要。近年来，具有高通量、低成本、易于现场化等众多优点的免疫检测技术，已逐渐应用于中药质量控制领域，其中酶联免疫检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)已被《中国药典》(2020年版)收录作为黄曲霉毒素的检测方法之一。目前，elisa已应用于多种中药材的质量检测，如金银花、大黄、马兜铃、葛根、人参、薏苡仁等中药材指标性成分均已建立相应的elisa检测方法。王文珺、huang y h等研究表明elisa可用于粮食及饲料中zen的残留检测，目前未见中药薏苡仁中zen残留elisa检测的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明以薏苡仁为研究对象，根据该药材的特点对检测试剂和前处理进行合理优化。利用单克隆抗体制备技术，制备zen的单克隆抗体，通过方法学考察，进而建立基于薏苡仁中zen单克隆抗体的直接竞争酶联免疫分析方法，为薏苡仁中zen残留的检测分析提供了一种快速、可靠的技术手段。具体技术方案如下：
5.一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原，具有式i所示的分子结构
6.7.其核磁共振氢谱参数如下：1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ：11.0(s,1h,cooh)，8.53(d,2h,arh)，7.53，7.49(d,2h,arh)，6.76(s,1h,arh)，5.89(s,2h,-hc＝ch-)，5.35(s,2h,aroh)，4.13(m,1h,-o-ch-)，2.79(t,2h,-ch2-)，2.51(t,2h,-ch2-)，2.44-2.47(m,4h,-ch2-c＝o-ch2-)，1.96(t,4h,-ch2-)，1.37(s,3h,-ch3)。
8.一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮人工抗原，是通过以下步骤制得：
9.合成上述的薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原：取3-(4-氨基苯基)丙酸100mg，加入40μl 1m稀盐酸，再加入1ml蒸馏水稀释溶解，冷却，搅拌，加入亚硝酸钠47mg，搅拌，得到3-(4-氨基苯基)丙酸的重氮盐溶液；取120mg zen加乙醇溶解，加入20mg碳酸钾，0℃搅拌，加入重氮盐溶液，搅拌；停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到半抗原产物；
10.制备玉米赤霉烯酮人工抗原：取15mg zen半抗原，溶解于3ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中；取30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，用1.0ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液a；分别称取30mg bsa，20mg ova，使之分别充分溶解在3.0ml pbs缓冲液中；将反应液a等分两份逐滴缓慢滴加到bsa和ova蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01m pbs于4℃透析3d，每天换液3次，离心分装，得到免疫原zen-bsa和包被原zen-ovaa偶联物。
11.一种薏苡仁玉米赤霉烯酮的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述酶标板的反应孔中包被有上述的玉米赤霉烯酮人工抗原。
12.一种薏苡仁玉米赤霉烯酮的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以及上述的玉米赤霉烯酮人工抗原。
13.优选地，所述试剂盒还包含pbst洗涤液，封闭液。
14.一种检测薏苡仁中玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤：
15.(1)获取标准曲线：以标准品的0μg
·
kg-1时的od450nm值为b0值，其他质量浓度的od450nm值为b值，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，百分吸光率值(b/b0
×
100％)为纵坐标，用originpro7.5软件绘制标准曲线；
16.各质量浓度的标准品的od450nm测定步骤如下：用包被缓冲液将包被抗原稀释至最佳工作浓度后，包被于酶标板上，100μl每孔，孵育；倾去孔内液体，用pbst洗涤，加入封闭液150μl每孔，孵育；去掉封闭液后，晾干；加入系列浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液50μl/每孔，再加入经酶标抗体稀释液稀释至最佳工作浓度的酶标单克隆抗体溶液50μl每孔，25℃避光反应30min；洗涤后加入显色液100μl每孔，25℃显色15min，加入终止液50μl每孔，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(od值)；
17.(2)称取1.0g待测薏苡仁粉末加入5ml 0.02m pbs，再加入5ml甲醇，剧烈振荡5min，4000r
·
min-1
离心5min，取上清液0.1ml加入0.4ml样品稀释液混合均匀，取50μl用于elisa测定，代替上述测定步骤中的标准溶液采用上述测定步骤测得样品的od450nm值，代入标准曲线得到待测薏苡仁粉末中玉米赤霉烯酮的质量浓度。
18.本发明的有益效果是：
19.本发明将zen半抗原通过与牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)偶联后获得zen的完全抗原。利用抗体制备技术，制备得到zen单克隆抗体4f6，该抗体与zen结构类似物玉米
赤霉醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇的交叉反应率分别为178％、137％和110％，与黄曲霉毒素等其它真菌毒素无交叉反应。本发明通过方法学考察，建立了基于zen单克隆抗体4f6的薏苡仁中zen的酶联免疫检测方法，方法的ic
50
为1.3μg
·
l-1
，检测范围为0.5～13.5μg
·
l-1
。加样回收率为83.9％～105.3％，变异系数为4.4％～8.0％。利用所建立的elisa方法，测定了9批薏苡仁样品中的zen残留量，并使用液相色谱-串联质谱法(lc-ms)进行验证，两种检测方法测定结果相关性良好(r2＝0.993 9)，表明所建立的elisa可用于薏苡仁中zen残留量的快速检测。
附图说明
20.图1是zen半抗原合成路线。
21.图2是zen的标准曲线。
22.图3是薏苡仁中zen残留elisa和uplc-ms测定结果相关性结果。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
24.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
25.实施例1
26.1材料与方法
27.1.1材料与仪器
28.2021年6月从北京多家药店和超市共购买9批次薏苡仁样品，经中国中医科学院中药资源中心金艳副研究员鉴定，样品均为禾本科植物薏苡coix lacryma-jobi l.var.ma-yuen(roman.)stapf的干燥成熟种仁(表1)。
29.表1药材样品信息
[0030][0031]
6～8周龄balb/c雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)；牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵清白蛋白(ova)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二环己基碳二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、3-(4-氨基苯基)丙酸(sigma公司)；辣根过氧化物酶(全式金生物技术有限公司)；玉米赤霉烯酮(纯度≥98.0％，加拿大triplebond公司)；玉米赤霉酮、玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇，黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2，呕吐毒毒素，赭曲霉毒素a等真菌毒素标准品(青岛普瑞邦生物工程有限公司)；辣根过氧化物酶标记试剂盒-氨基(东仁化学科技(上海)有限公司)；亚硝酸钠、乙腈、醋酸、巯基丙酸、乙酸乙酯、石油醚、吐温-20等其它分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)；96孔酶标板
(美国corning公司)。
[0032]
acquity uplc i-class系统(美国waters公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱)；qtrap 6500质谱仪(美国ab sciex公司)；色谱柱：waters acquity uplc beh c18色谱柱(2.1mm
×
100mm,1.7μm)；multiskan fc酶标仪(美国thermo公司)；2000sbl电子天(美国setra公司)；ks
‑ⅱ
振荡器(上海跃进医疗器械厂)；ql-901漩涡混合器(江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；anke tdl-40b低速离心机(上海安亭科学仪器有限公司)。
[0033]
1.2溶液配制
[0034]
包被缓冲液(coating buffer)：0.05m碳酸盐缓冲液(ph 9.6)；磷酸盐缓冲液(pbs)：含0.9％ nacl的0.01m磷酸盐缓冲液(ph 7.5)；封闭液：含质量分数5％卵清蛋白、5％乳粉的pbs；洗液(pbst)：含体积分数0.1％ tween-20的pbs；样品稀释液(pbstg)：含质量分数0.5％明胶的pbst；底物缓冲液(substrate buffer)：含体积分数0.1％ tween-20的0.01m柠檬酸三钠和0.03m的na2hpo4缓冲液(ph 5.5)；底物显色液(substrate solution)：10ml底物缓冲液中加入20mg opd和4μl h2o2；终止液(stop solution)：2m h2so4。
[0035]
1.3方法
[0036]
1.3.1 zen半抗原的合成
[0037]
取3-(4-氨基苯基)丙酸100mg，加入40μl 1m稀盐酸，再加入1ml蒸馏水稀释溶解，冷却到0℃，搅拌，加入亚硝酸钠47mg，搅拌2h，得到3-(4-氨基苯基)丙酸的重氮盐溶液；取120mg zen加乙醇溶解，加入20mg碳酸钾，0℃搅拌，加入重氮盐溶液，搅拌2h；停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅胶柱层析，用体积比为1∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到半抗原产物100mg，收率73％。合成路线如图1所示，并对其结构进行核磁共振氢谱鉴定。
[0038]
1.3.2 zen完全抗原的制备
[0039]
取15mg zen半抗原，溶解于3ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中；取30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，用1.0ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液a；分别称取30mg bsa，20mg ova，使之分别充分溶解在3.0ml pbs缓冲液中；将反应液a等分两份逐滴缓慢滴加到bsa和ova蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01m pbs于4℃透析3d，每天换液3次，离心分装，得到免疫原zen-bsa和包被原zen-ovaa偶联物。
[0040]
1.3.3动物免疫、单克隆抗体筛选及酶标抗体制备
[0041]
取健康6～8周雌性balb/c小鼠10只，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫原zen-bsa充分乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为200μg zen-bsa；之后加强免疫，每间隔两周颈背部皮下多点注射一次，乳化用弗氏不完全佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射。具体免疫程序见表2。第三次、四次、加强免疫后7d，取小鼠眼眶静脉丛血，间接竞争elisa测定小鼠血清抑制率。综合选取效价和特异性强的一只小鼠进行加强免疫，加强免疫后3d取脾细胞与sp 2/0骨髓瘤细胞融合，经过筛选、克隆和亚克隆等程序得到能稳定分泌抗zen抗体且灵敏度和特异性高的杂交瘤细胞株4f6，并制备腹水。腹水在4℃下5000r
·
min-1
离心5min，收集上清，并去掉腹水上层漂浮的脂肪和蛋白质膜，用饱和硫酸铵法对抗体进行纯化，0.01m pbs透析2d后-40℃冰箱保存。得到zen单克隆
抗体4f6为igg1类型，轻链为κ型。
[0042]
采用辣根过氧化物酶氨-基标记试剂盒对所制备的zen单克隆抗体4f6进行辣根过氧化物酶标记，具体实验操作按照试剂盒使用说明进行。
[0043]
表2小鼠免疫程序
[0044][0045]
1.3.4 elisa方法的建立
[0046]
用包被缓冲液将zen包被原(zen-ova)稀释至0.5μg
·
ml-1
，包被于96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h；甩掉包被液，pbst洗涤4次，拍干后每孔加入150μl封闭液，37℃孵育2h；倾去孔内液体，pbst洗涤4次，拍干后每孔加入系列浓度的zen标准溶液50μl，再每孔加入zen酶标单克隆抗体溶液(1.0μg
·
ml-1
)50μl，25℃避光反应30min；pbst洗涤4次，拍干后每孔加入显色液100μl，室温25℃显色15min，每孔加入终止液50μl终止反应，于450nm处测定每孔吸光度值(a)。以0μg
·
l-1
时的a值为b0值，其它浓度的a值为b值，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，百分吸光率值(b/b0×
100％)为纵坐标，originpro7.5绘制标准曲线。
[0047]
1.3.5样品前处理
[0048]
薏苡仁样品粉碎后过2号筛，精密称取1.0g薏苡仁粉末样品，加入5ml 0.02m pbs，再加入5ml甲醇，剧烈振荡5min，4000r
·
min-1
离心5min，取上清液0.1ml加入0.4ml样品稀释液混合均匀，取50μl用于elisa测定。另取样品，参照《中国药典》(2020年版)2351真菌毒素测定法中zen测定法第二法-液相色谱串联质谱法进行检测。
[0049]
1.3.6方法学考察
[0050]
1.3.6.1特异性
[0051]
抗体特异性以单克隆抗体与zen结构相近的化合物及其他真菌毒素的交叉反应率来表示。选择与zen结构相近的玉米赤霉酮、玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇以及黄曲霉毒素等其它真菌毒素，测定各化合物的50％抑制浓度(ic
50
)，并计算抗体的交叉反应率(zen对照品ic
50
/类似物ic
50
×
100％)。
[0052]
1.3.6.2加样回收率实验
[0053]
精密称取样本3和样本4粉末约1.0g进行添加回收实验，进行三个浓度水平的添加回收试验，分别为60、100、500μg
·
kg-1
，参照1.3.5进行样品前处理，计算回收率和变异系数。
[0054]
1.3.7 zen残留量检测
[0055]
分别按照1.3.4所建立的直接竞争elisa方法和《中国药典》(2020版)2351真菌毒素测定法中玉米赤霉烯酮测定法第二法-液相色谱串联质谱法进行待测样品中zen残留量检测。
[0056]
2结果与分析
[0057]
2.1 zen半抗原的鉴定
[0058]
制备的zen半抗原核磁共振氢谱鉴定结果为：1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ：11.0(s,1h,cooh)，8.53(d,2h,arh)，7.53，7.49(d,2h,arh)，6.76(s,1h,arh)，5.89(s,2h,-hc＝ch-)，5.35(s,2h,aroh)，4.13(m,1h,-o-ch-)，2.79(t,2h,-ch2-)，2.51(t,2h,-ch2-)，2.44-2.47(m,4h,-ch2-c＝o-ch2-)，1.96(t,4h,-ch2-)，1.37(s,3h,-ch3)。其中化学位移δ＝11.0的为羧基氢，δ＝2.51、2.79的为3-(4-氨基苯基)丙酸支链氢，δ＝8.53、7.49为3-(4-氨基苯基)丙酸苯环上的氢，这些化学位移氢的吸收峰的存在证明重氮偶合反应成功，证明zen半抗原结构正确。
[0059]
2.2 elisa方法的建立
[0060]
经筛选，zen系列标准溶液浓度分别为0、0.15、0.50、1.50、5.00、15.00、30.00μg
·
l-1
，测定其a值，以百分吸光率(％)为纵坐标，zen系列标准溶液浓度的对数值为横坐标建立elisa标准曲线(图2)。所建立的elisa标准曲线工作范围为0.22～21.92μg
·
l-1
，ic
50
为1.3μg
·
l-1
。
[0061]
2.4方法学考察
[0062]
交叉反应实验结果显示，zen的单克隆抗体4f6与玉米赤霉酮、玉米赤霉醇和α-玉米赤霉烯醇的交叉反应分别为137％、178％和110％，与黄曲霉毒素等其它真菌毒素无交叉反应。zen的单克隆抗体4f6虽与玉米赤霉烯酮的结构类似物玉米赤霉酮、玉米赤霉醇和α-玉米赤霉烯醇具有较高的交叉反应，但因薏苡仁样品中并未检测出上述三种玉米赤霉烯酮结构类似物，因此并不影响实际检测结果。
[0063]
从添加回收结果可见(表3)，所建立的直接竞争elisa方法的添加回收率为83.9％～105.3％，变异系数介于4.4％～8.0％之间。
[0064]
表3 zen的elisa检测方法的加样回收率
[0065][0066]
2.5样品含量测定
[0067]
9批薏苡仁样本中的zen残留量经elisa和uplc-ms测定，9批样品中zen残留量均低于500μg
·
kg-1
《中国药典》(2020年版)规定的标准，且两种检测方法的测定结果一致性较好(表4，图3，r2＝0.993 9)，表明所建立的直接竞争elisa可以用于薏苡仁中zen残留量的定量检测。
[0068]
表4薏苡仁中zen残留量elisa与uplc-ms测定结果
[0069][0070]
4结论与讨论
[0071]
液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫等多种检测方法均可实现zen残留量的检测，但液相色谱法实验过程繁琐复杂、液相色谱-串联质谱法仪器价格昂贵。面对高通量、快速、高灵敏度和高特异性的需要，本研究基于zen单克隆抗体4f6建立了中药薏苡仁zen残留的直接竞争elisa检测方法。该方法测定结果与uplc-ms检测结果的相关性线性方程为y＝1.004 7x+1.091 2，相关系数r2＝0.993 9，两方法相关性良好，表明本研究所建立的直接竞争elisa可以用于薏苡仁药材中zen残留的快速筛查。