一株乙酸钙不动杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株乙酸钙不动杆菌及其应用。


背景技术：

2.随着经济的飞速发展和工业化进程的加快，石油作为主要能源在日常生活和生产建设中被大量使用。然而，由于硫元素占原油质量的0.03-7.89％之间，是除碳、氢外，最多的成分，燃烧后会产生大量的二氧化硫，二氧化硫排入到大气中后会以酸雨的形式降落下来，对人体的呼吸系统和消化系统造成伤害，同时腐蚀植物，破坏生态环境。随着人们对环境污染的不断重视，世界各国纷纷出台了一系列日益严苛的法规来控制成品油的硫水平，因此，迫切需要一种高效环保的石油脱硫技术来解决当前石油硫含量高的难题。
3.高硫原油具有硫含量大，成分复杂，粘度高等特点，直接对其精练成本高，且脱硫不完全。如果在原油冶炼前将硫含量降到一个较低的水平就可以大大降低下游处理压力与成本。与传统的物理和化学脱硫法相比，生物脱硫法(bds)所需操作温度和压力均较低，且能有效去除杂环类有机硫，因此具有广阔的应用前景。二苯并噻吩及其衍生物是高硫原油的重要组成，二苯并噻吩在原油中的含量大，且去除困难，具有很好的代表性，因此，在石油脱硫的研究中常以dbt作为模型化合物。在环境要求日益严格的今天，石油的生物脱硫势在必行。因此，从自然界中采集和分离脱硫菌株，并筛选出合适的原油脱硫菌，不但能够提高石油的利用率，而且对改善生态环境也具有非常积极的作用。目前己经发现许多微生物，如红球菌、假单胞菌、戈登氏菌、棒杆菌、分支杆菌和节杆菌等，它们能够沿着硫专一途径降解dbt，它们不打开这些含硫化合物的苯环结构，因而保留了燃料的热值，具有较大的应用前景，成为近年来研究的热点。
4.虽然目前已经分离出很多能够用于石油bds过程的菌株，但是距离原油bds的商业化应用还存在种种限制因素，比如首先原油具有硫含量大，成分复杂，对脱硫菌有毒害作用，影响了菌剂活性与寿命；其次原油开采运输过程中往往温度较高，抑制了生物脱硫的活性；第三，原油粘度大，微生物作用时难以完全接触，降低降解效率，因此虽然已经分离出很多原油脱硫菌株，但是还需继续拓宽原油脱硫菌的品种，开发对原油毒性、温度有较高耐受性，可以降低原油粘度、增大接触面积的高效脱硫菌株与方法，加快生物脱硫(bds)大规模工业化的进程。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一株乙酸钙不动杆菌及其应用，该菌株对高硫原油具有明显的脱硫及乳化降粘的效果。
6.本发明从山东京博石油化工有限公司石油焦和储油罐底泥中分离纯化得到菌株yjy22-13。
7.本发明所述菌株筛选方法：将上述样品分别在30-50℃条件下，依次经含有0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l的二苯并噻吩(dbt)的液体无机
盐基础培养基进行梯度驯化培养2～3天后，在含有相应浓度dbt的固体无机盐培养基上分离单菌落，尽可能获得耐高温且耐受dbt浓度高单菌落，对最终获得的单菌落进行dbt效果验证与代谢途径验证，其代谢途径鉴别方法如下：将在含dbt的液体基础培养基培养2～3天的菌液离心除菌体，取上清液并将其ph调至8.0，加少量gibb's试剂，呈现蓝色说明培养液中有dbt降解后的2-羟基联苯存在。
8.本发明中，所述培养的无机盐基础培养基包括水和如下组分：2～3g/l kh2po4，10～15g/l na2hpo4.12h2o，0.3～0.5g/l mgcl2.6h2o，0.001～0.01g/l cacl2.2h2o，0.001～0.01g/l fecl3.6h2o，0.001～0.01g/l mncl2.4h2o，1～3g/l nh4cl。
9.yjy22-13菌株的16srdna核苷酸序列如seq id no：1所示；经16s rdna鉴定该菌株为乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)，其保藏编号为cgmcc no.24322。
10.本发明不动杆菌cgmcc no.24322可在两相体系中，产生表面活性剂，乳化体系并降低原油粘性将原油分散成小油滴。
11.本发明还提供一种微生物菌剂，其原料包括保藏编号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌。
12.本发明中，所述微生物菌剂包括：本发明所述的乙酸钙不动杆菌的活菌和/或灭活菌，
13.和/或，本发明所述的乙酸钙不动杆菌的培养物、提取物。
14.本发明还提供了所述的微生物菌剂的制备方法，包括：步骤1：将保藏编号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌接种于含dbt的无机盐培养基培养，获得细胞培养液；
15.步骤2：取所述细胞培养液离心，收集细胞沉淀，重悬细胞，获得静息细胞悬浊液；
16.步骤3：取所述细胞培养液离心，收集细胞沉淀，与冻干保护剂混合，经冻干获得所述的微生物菌剂。
17.一些实施方案中，所述含dbt的无机盐培养基中，dbt的浓度为0.1-0.5mmol/l，具体可为0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l或0.5mmol/l。
18.一些实施方案中，所述培养为30-50℃，180转/min培养2-3天
19.一些实施方案中，步骤2中，采用ph 7.0的100mm磷酸钾缓冲液重悬细胞，至菌体浓度达到5-20克干细胞/升。
20.一些具体实施例中，本发明提供的微生物菌剂的制备方法包括：
21.(1)细胞培养：选择保藏编号为cgmcc no.24322的不动杆菌接种于0.1-0.5mmol/l dbt的无机盐培养基培养30-50℃180转/min培养2-3天，获得细胞培养液；
22.(2)制备静息细胞悬浊液：取步骤(1)所得的培养液4,500转/min离心15-20min，收集沉淀细胞，使用ph 7.0的100mm磷酸钾缓冲液重悬细胞，反复2-3次，使菌体浓度达到5-20克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的静息细胞悬浊液；
23.(3)取步骤(1)所得的培养液4,500转/min离心15-20min，收集沉淀细胞，与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉，即本发明所述的微生物菌剂。
24.本发明还提供了所述的乙酸钙不动杆菌、所述的微生物菌剂在原油脱硫中的应用。
25.本发明还提供一种原油脱硫的方法，将本发明所述的乙酸钙不动杆菌、所述的微生物菌剂或本发明所述的制备方法中所制得的细胞培养液、静息细胞悬浊液或微生物菌剂
加入到含有原油的油水两相体系中，进行脱硫反应。
26.一些实施方案中，所述原油与水相的体积比为1:5～20；所述脱硫反应的条件为：30～50℃，180转/min振荡48-72h。一些实施方案中，所述原油与水相的体积比优选为1:10～20；所述脱硫反应的温度优选为35～45℃，振荡时间优选为60～72h。
27.本发明所述应用中不动杆菌cgmcc no.24322可在两相体系中，产生表面活性剂，乳化体系并降低原油粘性将原油分散成小油滴。
28.本发明所述的不动杆菌cgmcc no.24322与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)可以降解二苯并噻吩(dbt)生成2-羟基联苯，不损失原油的的燃料值，降解率高，耐受性强，5mmol/ldbt降解率达到90％以上，最高可耐受20mmol/ldbt；(2)对高硫原油脱硫活性高，油水比1:20、35℃时，对高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率达到13.38％(3)可以耐受较高油水比与处理温度，1:10～20油水比和40～50℃下仍有脱硫活性；45℃对5mmol/ldbt 72h降解率达到58.32％，45℃油水比1:20时对高硫原油(硫含量为34485mg/l)脱硫率为10.02％；(4)最后可在两相体系中，本发明所述乙酸钙不动杆菌对高硫原油具有明显的乳化降粘的效果，形成明显的乳化小油滴。
29.综上，本发明获得的乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322能稳定降解二苯并噻吩(dbt)生成2-羟基联苯，不损失原油的的燃料值，对dbt降解率高、耐受性强，原油脱硫处理中可耐受较高油水比和处理温度，并且还可以产生表面活性物质，表现出明显的乳化降粘的效果，具有驱油、降低原油粘性、增大菌剂处理的接触面积等优点，本发明所述的乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322的发现，拓宽了原油脱硫菌的品种，有助于加快生物脱硫(bds)大规模工业化的进程，在原油脱硫和环保技术领域都具有良好的应用前景。
30.生物保藏说明
31.yjy22-13，分类命名：乙酸钙不动杆菌acinetobacter calcoaceticus，于2022年1月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24322。
附图说明
32.图1示乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322对二苯并噻吩(dbt)的耐受性；
33.图2示乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322在油水两相中分散小液滴(宏观)(2-a空白组，2-b实验组)；
34.图3示乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322在油水两相中将原油分散为小液滴(微观)(3-a空白组，3-b实验组)。
具体实施方式
35.本发明公开了一株乙酸钙不动杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
36.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
37.实施例1：本发明所述乙酸钙不动杆菌的筛选、分离与鉴定
38.a、菌株的分离筛选
39.将取自山东京博石油化工有限公司石油焦和储油罐底泥的样品，分别在30-50℃条件下，依次经含有0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l的二苯并噻吩(dbt)的液体无机盐基础培养基进行梯度驯化培养2～3天后，在含有相应浓度dbt的固体无机盐培养基上分离单菌落，尽可能获得耐高温且耐受dbt浓度高单菌落，对最终获得的单菌落进行dbt效果验证与代谢途径验证。
40.所述培养的无机盐基础培养基包括水和2.44g/l kh2po4，14.03g/l na2hpo4.12h2o，0.36g/l mgcl2.6h2o，0.001g/l cacl2.2h2o，0.001g/l fecl3.6h2o，0.004g/l mncl2.4h2o，2g/l nh4cl。
41.所述代谢途径鉴别方法如下：将在含有dbt的基础培养基培养2～3天的菌液离心除菌体，取上清液并将其ph调至8.0，加少量gibb's试剂，呈现蓝色说明培养液中有dbt降解后的2-羟基联苯存在。
42.b、效果验证
43.将上述a过程中分离到的可以降解二苯并噻吩(dbt)生成2-羟基联苯的单菌落，分别经含有0.1～0.5mmol/l的二苯并噻吩(dbt)的液体基础培养基进行梯度驯化培养2～3天后，再分别接入0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l的二苯并噻吩(dbt)的液体无机盐基础培养基35℃下180转/min培养48～72h进行效果验证，利用dbt在330nm处有显著吸收峰值的特性采用吸光光度法对dbt降解率进行检测，最终获得一株具有高效dbt降解活性的菌株yjy22-13，48h可完全降解0.5mmol/ldbt。
44.c、菌种保藏与鉴定
45.将最终获得的菌株yjy22-13进行甘油管与斜面保藏，委托济南博尚生物工程有限公司进行pcr扩增以及测序，获得16s rdna序列如附录，经鉴定为乙酸钙不动杆菌，于2022年1月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24322。
46.实施例2：本发明所述乙酸钙不动杆菌对dbt降解特性
47.按照实施例1中a、b的方法，进一步研究本发明所述乙酸钙不动杆菌对dbt的降解特性，dbt浓度增至0.5～5mmol/l，处理温度分别为30～50℃，180转/min培养48～72h。结果表明，不动杆菌cgmcc no.24322对dbt降解温度最适为35℃，此时对5mmol/ldbt 72h降解率达到90.51％，但是在40～50℃对dbt仍有降解作用，45℃对5mmol/ldbt 72h降解率达到58.32％.
48.表1本发明所述乙酸钙不动杆菌对5mmol/ldbt降解情况
49.[0050][0051]
实施例3：本发明所述乙酸钙不动杆菌对dbt耐受性
[0052]
按照实施例1中a、b的方法，进一步研究本发明所述乙酸钙不动杆菌对dbt的耐受性，dbt浓度增至5～20mmol/l，处理温度为35℃，180转/min培养72h。结果表明，不动杆菌cgmcc no.24322对dbt耐受性较高，对5、8、10、15、20mmol/l dbt 72h降解率分别为90.24％、86.89％、61.03％、30.80％和3.93％，结果见图1和表2。
[0053]
表2本发明所述乙酸钙不动杆菌对dbt耐受性
[0054]
dbt浓度mmol/l72h降解率％590.24886.891061.031530.80203.93
[0055]
实施例4：利用本发明所述乙酸钙不动杆菌静息细胞脱除原油中有机硫的方法，其中原油与水相的体积比分别为1:10、1:15、1:20，处理温度为35℃
[0056]
本发明所述乙酸钙不动杆菌在原有脱硫中的应用，具体方法与步骤如下：
[0057]
(1)细胞培养：选择保藏编号为cgmcc no.24322的不动杆菌接种于0.5mmol/l dbt的无机盐培养基培养35℃，180转/min培养2天，获得细胞培养液；
[0058]
(2)制备静息细胞悬浊液：取步骤(1)所得的培养液4,500转/min离心15min，收集沉淀细胞，使用ph 7.0的100mm磷酸钾缓冲液重悬细胞，反复3次，使菌体浓度达到10克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的静息细胞悬浊液；
[0059]
(3)样品处理：在反应体系中，以步骤(2)获得的休止细胞悬浊液为水相，添加到原油中配成两相体系，使原油与水相的体积比为1:5～20，在35℃条件下，180转/min振荡72h，进行样品处理；
[0060]
(4)分离样品：以10,000转/min离心10分钟分离步骤(3)中处理后的样品，得到上层原油样品；
[0061]
(5)样品检测：使用wk-2d型微库伦仪测定上述原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经所述乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322处理高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率。
[0062]
本发明中所述培养的无机盐培养基包括水，2.44g/l kh2po4，14.03g/l na2hpo4.12h2o，0.36g/l mgcl2.6h2o，0.001g/l cacl2.2h2o，0.001g/l fecl3.6h2o，0.004g/l mncl2.4h2o，2g/l nh4cl。
[0063]
本发明所述乙酸钙不动杆菌在油水比1:10～20对高硫原油仍有脱硫活性，对35℃脱除高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率在油水比1:10、1:15、1:20时分别为3.45％、
8.87％、13.38％。
[0064]
表3本发明所述乙酸钙不动杆菌35℃下不同油水比原油脱硫情况
[0065]
油水比72h脱硫率％1:501:103.451:158.871:2013.38
[0066]
实施例5
[0067]
利用本发明所述乙酸钙不动杆菌细胞培养液脱除原油中有机硫的方法，其中原油与水相的体积比为1:20，处理温度为35℃。
[0068]
本发明所述乙酸钙不动杆菌在原油脱硫中的应用，具体方法与步骤如下：
[0069]
(1)细胞培养：选择保藏编号为cgmcc no.24322的不动杆菌接种于0.5mmol/l dbt的无机盐培养基培养35℃，180转/min培养2天，获得细胞培养液；
[0070]
(2)将上述细胞培养液加入到液体无机盐培养基中，使菌体浓度达到12克干细胞/升，获得水相；
[0071]
(3)样品处理：在反应体系中，以步骤(2)获得的含细胞培养液的水相，添加到原油中配成两相体系，使原油与水相的体积比为1:5～20，在35℃条件下，180转/min振荡72h，进行样品处理；
[0072]
(4)分离样品：以10,000转/min离心10分钟分离步骤(3)中处理后的样品，得到上层原油样品；
[0073]
(5)样品检测：使用wk-2d型微库伦仪测定上述原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经所述乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322处理高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率。
[0074]
本发明中所述培养的无机盐基础培养基包括水，2.44g/l kh2po4，14.03g/l na2hpo4.12h2o，0.36g/l mgcl2.6h2o，0.001g/l cacl2.2h2o，0.001g/l fecl3.6h2o，0.004g/l mncl2.4h2o，2g/l nh4cl。
[0075]
本发明所述乙酸钙不动杆菌细胞培养液在35℃、油水比1:20，对高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率为13.16％，与静息细胞悬浊液脱硫效果相当。
[0076]
实施例6
[0077]
利用本发明所述乙酸钙不动杆菌静息细胞脱除原油中有机硫的方法，其中原油与水相的体积比为分别为1:20，处理温度分别为40、45、50℃
[0078]
本发明所述乙酸钙不动杆菌在原油脱硫中的应用，具体方法与步骤如下：
[0079]
(1)细胞培养：选择保藏编号为cgmcc no.24322的不动杆菌接种于0.5mmol/l dbt的无机盐培养基培养35℃，180转/min培养2天，获得细胞培养液；
[0080]
(2)制备静息细胞悬浊液：取步骤(1)所得的培养液4,500转/min离心15min，收集沉淀细胞，使用ph 7.0的100mm磷酸钾缓冲液重悬细胞，反复3次，使菌体浓度达到10克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的静息细胞悬浊液；
[0081]
(3)样品处理：在反应体系中，以步骤(2)获得的休止细胞悬浊液为水相，添加到原油中配成两相体系，使原油与水相的体积比为120，分别在40、45、50℃条件下，180转/min振
荡72h，进行样品处理；
[0082]
(4)分离样品：以10,000转/min离心10分钟分离步骤(3)中处理后的样品，得到上层原油样品；
[0083]
(5)样品检测：使用wk-2d型微库伦仪测定上述原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经所述乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322处理高硫原油(硫含量为34485mg/l)的脱硫率。
[0084]
本发明中所述培养的基础培养基包括水，2.44g/l kh2po4，14.03g/l na2hpo4.12h2o，0.36g/l mgcl2.6h2o，0.001g/l cacl2.2h2o，0.001g/l fecl3.6h2o，0.004g/l mncl2.4h2o，2g/l nh4cl。
[0085]
本发明所述乙酸钙不动杆菌在油水比1:20时对高硫原油(硫含量为34485mg/l)的在40～50℃仍有脱硫活性，其中40℃、45℃、50℃脱硫率分别为11.28％、10.02％、6.33％。
[0086]
表4本发明所述乙酸钙不动杆菌在油水比1:20时不同温度下的原油脱硫率
[0087]
温度℃72h脱硫率％4011.284510.02506.33
[0088]
实施例7：本发明所述乙酸钙不动杆菌对高硫原油乳化降粘的应用
[0089]
将乙酸钙不动杆菌cgmcc no.24322的生长态细胞培养液，添加到含有原油的油水两相体系，空白用相同基础培养液做对比，使原油与水相的体积比为1:5～20，在30～50℃条件下，180转/min振荡72h，分别通过肉眼与显微镜观察乳化降粘的宏观与微观状态，并测定乳化粘度，结果表明本发明所述乙酸钙不动杆菌对高硫原油具有明显的乳化降粘的效果，形成明显的乳化小油滴(见图2～3)，45℃、油水比1:5时乳化降粘率为33.91％。
[0090]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。