一种线性双链DNA的体外扩增方法与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种线性双链dna的体外扩增方法。

背景技术：

1、滚环扩增技术是一种简单的恒温dna扩增技术，在dna聚合酶(phi29)的催化下通过扩增闭合环状模板产生成千上万的重复序列。相较于变温核酸扩增技术如聚合酶链式反应，rca不需要昂贵的变温仪器，更适合现场检测。rca借鉴了微生物种环状dna复制方式。以phi29dna聚合酶，在30 37℃左右进行扩增。

2、目前大量扩增dna常规利用复制的质粒或病毒载体进行，此为体内合成方法的传统方法。该传统方法需要80ml至5l的液体培养基培养细菌，培养过程中需要控制培养基的ph，氧气浓度，培养基的补料速度，并且，培养完成后需要经过十几道步骤进行纯化方可得到dna。同时dna纯化需要除去对哺乳动物具有毒性的内毒素，所以整个dna纯化的工艺要求与成本比较高。

3、有研究表明可以在体外(无细胞)合成dna，避免了体内合成方法的一些缺陷，例如不需要细菌发酵，没有细菌内毒素，同时降低了生产成本。但是目前的体外扩增是基于质粒直接进行滚环复制，这样很多的原料用于扩增质粒的骨架序列(质粒复制相关的ori序列、筛选相关的抗性基因序列)，造成了资源的浪费，同时这些序列还会被错包进入aav病毒衣壳，降低aav病毒的纯度和效价，带来不可预测的副作用，给体内的基因治疗带来风险。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种线性双链dna的体外扩增方法。本发明的体外扩增方法与传统生产质粒的方法相比，不需要细菌发酵，dna纯化中不含有细菌内毒素，不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列，能够快速扩增大量的线性双链dna，并同时降低产品纯化的成本。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、本发明提供了一种线性双链dna的体外扩增方法，包括以下步骤：

4、(1)以dna模板为模板，在至少一组引物存在下，进行pcr扩增；

5、(2)将pcr扩增所得产物依次进行酶切和自连，获得包含至少一段腺相关病毒载体靶序列的环状双链dna模板；

6、(3)将步骤(2)所得的环状双链dna模板在至少一组引物、至少一种dna聚合酶存在的条件下扩增，将扩增所得产物切割，获得线性双链dna。

7、本发明提供了在体外无细胞条件下大量制备线性双链dna的方法，该方法与传统生产质粒的方法相比，不需要细菌发酵，dna纯化中不含有细菌内毒素，不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列，能够快速扩增大量的线性双链dna，并同时降低产品纯化的成本。

8、本发明去除了质粒的骨架序列，然后连接生成小环进行滚环复制，所有扩增的序列都是腺相关病毒所需序列，没有资源的浪费，同时避免了错包序列进入腺相关病毒衣壳，让腺相关病毒的体内使用更加安全可靠。

9、本发明的方法在经过dna聚合酶滚环扩增后，可以得到大量的线性双链dna，并经过相关实验验证，扩将增得到的线性双链dna进行酶切，其扩增条带是正确的。

10、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，将pcr扩增所得产物进行自连的方法为：使用限制性内切酶酶切pcr扩增所得产物，然后通过dna连接酶连接酶切后的pcr产物。

11、本发明可以直接通过pcr的方式将生产aav病毒所需序列扩增出来，在pcr引物上进入限制性内切酶位点，用限制性内切酶切除，然后自连成小环。优选地，限制性内切酶包括fastdigest hindiii。

12、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，采用限制性内切酶对pcr扩增所得产物进行酶切，所述限制性内切酶包括fastdigest hindiii或i-scei。

13、步骤(2)中，采用不同的限制性内切酶(例如fastdigest hindiii或i-scei)切割pcr扩增所得产物，获得的产物测序结果是与dna模板测序结果是相符合的，说明体外扩增方法扩增的线性双链dna序列是正确的，可以有效扩增出线性双链dna。

14、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，将pcr扩增所得产物进行自连后，加入核酸酶消化未完成自连的pcr扩增所得产物。

15、加入核酸酶消化未完成自连的pcr扩增所得产物，以保留完成自连的pcr扩增所得产物，有利于体外扩增线性双链dna的实现。

16、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述环状双链dna模板包括生产腺相关病毒的goi质粒，所述生产腺相关病毒的goi质粒为敲除了质粒复制原件ori序列和原核筛选用的抗性基因的生产腺相关病毒的goi质粒。

17、所述环状双链dna模板不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列，能够快速扩增大量的线性双链dna。

18、goi质粒在细菌发酵过程中，有些质粒产量不高，如果采用本发明dna体外扩增的方法，可以保证所有的goi质粒都能有稳定的产量，有利于生产线性双链dna。

19、质粒复制原件ori序列和原核筛选用的抗性基因序列在生产aav病毒的过程中，可能被错包进入aav病毒衣壳。为了避免这种情况的发生，申请人首先把goi质粒去除了这些序列，然后连接生成小环。

20、本发明去除了goi质粒的骨架序列，然后连接生成小环进行滚环复制，所有扩增的序列都是aav病毒所需序列，没有资源的浪费，同时避免了错包序列进入aav病毒衣壳，让aav的体内使用更加安全可靠。

21、所述环状双链dna模板，可以含有端粒酶识别的切割序列，也可以含有限制性内切酶识别的切割序列。

22、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述dna聚合酶包括phi29 dna聚合酶。

23、主要利用phi29 dna聚合酶可以常温大量扩增dna的特征。phi29 dna聚合酶是一个常温扩增的dna合成酶，广泛用于二代测序的相关实验。常温扩增还有别的系统，rpa，lamp等。phi29是自然界保真度最高的dna合成酶。

24、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述引物包括t4-5itr-f2-p、t4-3itr-r2-p、t4-5itr-f2、t4-3itr-r2，所述t4-5itr-f2-p的序列如seqid no:1所示；所述t4-3itr-r2-p的序列如seq id no:2所示；所述t4-5itr-f2的序列如seqid no:3所示；所述t4-3itr-r2的序列如seq id no:4所示；所述步骤(3)中，所述引物为特异性引物或随机引物。

25、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述特异性引物包括g-3itr-r和g-5itr-f，所述g-3itr-r的序列如seq id no:5所示；所述g-5itr-f的序列如seq id no:6所示。

26、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述引物t4-5itr-f2-p和t4-3itr-r2-p在5'端添加有磷酸化修饰，所述引物t4-5itr-f2和t4-3itr-r2不作任何修饰。

27、pcr的引物5'添加磷酸化修饰，可以让连接形成小环的效率提高。

28、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述随机引物为随机六聚体引物；所述随机六聚体引物的序列为：nnnnnn，其中n＝a、g、c或t。

29、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述步骤(3)中的扩增为滚环扩增，所述线性双链dna包括两个或更多个串联拷贝的环状双链dna模板。

30、作为本发明所述体外扩增方法的优选实施方式，所述体外扩增方法中不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列。

31、体外扩增方法中不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列，可以连接生成小环进行滚环复制，所有扩增的序列都是aav病毒所需序列，没有资源的浪费，同时避免了错包序列进入aav病毒衣壳，让aav的体内使用更加安全可靠。

32、优选地，dna模板包括k4_lacz[ssaav.cmv.egfp.wpres.sv40pa]或[ea0216]ssaav.cag.fluc-2a-egfp.wpre.sv40pa。

33、本发明还提供了上述体外扩增方法扩增得到的线性双链dna。

34、使用gibson自连的模板([ea0216]ssaav.cag.fluc-2a-egfp.wpre.sv40pa)获得的线性双链dna含有egfp与luciferase基因，经过检测，该线性双链dna可以有效表达egfp蛋白及luciferase酶，说明采用上述的体外的合成方法可以有效扩增出线性双链dna，与dna模板的序列是相符合的。

35、本发明还提供了一种腺相关病毒包装质粒，所述包装质粒包括上述的线性双链dna。

36、本发明还提供了一种转染细胞，所述转染细胞包括上述的腺相关病毒包装质粒。所述转染细胞包括hek-293细胞。本发明所涉及到的转染细胞包括生物领域中常常使用到的转染细胞，本发明的转染细胞不仅限于此。

37、本发明还提供了上述线性双链dna在制备高产量的腺相关病毒中的应用。

38、通过本发明体外扩增方法获得的线性双链dna都能获得高产的aav病毒，病毒滴度较高。

39、本发明还提供了上述线性双链dna联合腺相关病毒元件辅助质粒在制备高产量的腺相关病毒中的应用。

40、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述腺相关病毒元件辅助质粒包括rc质粒和/或helper质粒。腺相关病毒元件辅助质粒也不仅限于此，包括了能辅助本发明目的实现的腺相关病毒元件辅助质粒均在本发明的保护范围之内。

41、优选地，线性双链dna联合腺相关病毒元件辅助质粒的方案包括线性双链dna、rc质粒和helper质粒的组合。

42、在一些实施例中，采用goi质粒+rc质粒+helper质粒生产腺相关病毒(aav)的病毒滴度与采用goi-dna+rc质粒+helper质粒生产腺相关病毒(aav)的病毒滴度相似，均可以获得高产的aav病毒。

43、当线性双链dna联合腺相关病毒元件辅助质粒可以获得高产的aav病毒，病毒的滴度较高。

44、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

45、本发明提供了一种线性双链dna的体外扩增方法，在体外无细胞条件下大量制备线性双链dna的方法，该方法与传统生产质粒的方法相比，不需要细菌发酵，dna纯化中不含有细菌内毒素，不含有质粒复制相关的dna序列，不含有原核抗性基因的dna序列，能够快速扩增大量的线性双链dna，并同时降低产品纯化的成本。本发明的方法在经过dna聚合酶滚环扩增后，可以得到大量的线性双链dna，并经过相关实验验证，扩将增得到的线性双链dna进行酶切，其扩增条带是正确的。