一种检测可复制性慢病毒的探针、引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及基因和细胞治疗领域。具体涉及一种检测可复制性慢病毒的探针、引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、基因治疗产品是近年来国内外药物研发的热点，通常由各种病毒或非病毒载体携带治疗基因组成。在病毒载体中，慢病毒载体(lvs)由于其有效的将基因整合进靶细胞基因组、稳定的基因表达等特点，被认为是最有希望的基因治疗载体。考虑到慢病毒对人的病原性及相关的安全性，所使用的慢病毒载体均为复制缺陷型载体，但在病毒载体生产过程中可能由于同源重组或非同源重组导致可复制性慢病毒(replication competentlentivirus，rcl)的产生，rcl可以整合到细胞基因组中，从而导致原癌基因激活，抑癌基因破坏等，因此，这类产品中的复制型慢病毒检测是安全性检测中非常重要的项目，美国fda及中国cde都要求在生产的整个过程及不同阶段都要进行rcl检测，以确保无rcl的污染。

2、对于rcl的检测fda推荐以细胞培养为基础的感染性试验，该方法首先将可能存在的rcl在敏感细胞上扩增，在培养的终点利用敏感快速的检测方法进行检测，因此，高灵敏度的rcl检测方法是提高细胞治疗产品安全性的一个重要措施。现有技术中报道的rcl检测方法，例如lindsey m et.al.,detection of replication competent lentivirus usinga qpcr assay for vsv-g,mol ther methods clin dev.2017sep 21；8:1-7,标准曲线的斜率为3.3422±0.2354，且r2≥0.99。该方法的检测限为10个拷贝，检出率为97.92％。现有技术中的rcl检测方法的检测灵敏度、检出率、检测限等方面均有可提升之处，以进一步提高细胞治疗产品的安全性。

技术实现思路

1、为解决现有技术的rcl检测方法的检测灵敏度、检出率、检测限等方面有待提升的问题，本发明提供了一种检测可复制性慢病毒的探针、引物、试剂盒及其应用。本发明建立的检测方法具有较高的灵敏度，假阳性低，可联合细胞培养法应用于car-t细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞样品中的可复制性慢病毒检测，也可用于已有rcl安全性数据积累的car-t细胞样本的快速放行检测，可以有效的作为细胞治疗产品生产环节中的质控手段。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明提供的技术方案之二为：一种探针，所述探针的核苷酸序列如seq id no:3所示。

4、本发明提供的技术方案之三为：一种试剂盒，所述试剂盒包括如技术方案之一所述的引物对和如技术方案之二所述的探针。

5、在一些实施方案中，所述的试剂盒，其还包括可复制性慢病毒的参考品、taq酶、dntp、mg2+、反转录酶、rnase free h2o、扩增缓冲液和上样缓冲液中的一种或多种。所述参考品为dna或rna分子。

6、本发明提供的技术方案之四为：一种检测可复制性慢病毒的方法，其用如技术方案之三所述的试剂盒来检测可复制性慢病毒。

7、在一些实施方案中，所述的方法包括以下步骤：

8、(i)获得样品中的核酸；

9、(ii)将所述核酸和标准品在同一反应体系下，在qpcr仪中进行扩增；

10、(iii)根据标准曲线，计算所述核酸的拷贝数。

11、在一些实施方案中，如技术方案之四所述的方法，步骤(ii)包括：(a)rna反转录(b)高温变性和(c)循环扩增；其中(a)的反应条件为50～60℃10～15min；(b)的反应条件为90～98℃10～30s；(c)的反应条件为90～98℃10～30s，58～62℃30s～1min，35～40个循环；优选地，

12、(a)的反应条件为50℃15min；(b)的反应条件为95℃30s；(c)的反应条件为95℃15s，60℃1min，40个循环。

13、在一些实施方案中，如技术方案之四所述的方法，步骤(iii)中，用rnase freeh2o将所述质粒dna参考品进行梯度稀释，获得5～10个浓度的标准品，将所述标准品与样品在同一块pcr板中进行扩增，即得所述标准曲线；

14、在一些优选的实施方案中，所述梯度稀释为10倍稀释，所述标准品含6～7个浓度。

15、如技术方案之一所述的引物对、技术方案之二所述的探针或技术方案之三所述的试剂盒在制备检测可复制性慢病毒的诊断剂中的应用。

16、本发明的积极进步效果在于：

17、本发明建立的检测方法以针对包膜基因片段的荧光定量pcr为基础，具有较高的灵敏度，假阳性低，可联合细胞培养法应用于car-t细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞样品中的可复制性慢病毒检测，也可用于已有rcl安全性数据积累的car-t细胞样本的快速放行检测，可以有效的作为细胞治疗产品生产环节中的质控手段。

技术特征：

1.一种引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。

2.一种探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如seq id no:3所示。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对和如权利要求2所述的探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括可复制性慢病毒的参考品、taq酶、dntp、mg2+、反转录酶、rnase free h2o、扩增缓冲液和上样缓冲液中的一种或多种。

5.一种检测可复制性慢病毒的方法，其特征在于，其用如权利要求3或4所述的试剂盒来检测可复制性慢病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(ii)包括：(a)rna反转录；(b)高温变性和(c)循环扩增；其中(a)的反应条件为50～60℃10～15min；(b)的反应条件为90～98℃10～30s；(c)的反应条件为90～98℃10～30s，58～62℃30s～1min，35～40个循环。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，(a)的反应条件为50℃15min；(b)的反应条件为95℃30s；(c)的反应条件为95℃15s，60℃1min，40个循环。

9.如权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，用rnase free h2o将所述质粒dna参考品进行梯度稀释，获得5～10个浓度的标准品，将所述标准品与样品在同一块pcr板中进行扩增，即得所述标准曲线；优选地，所述梯度稀释为10倍稀释，所述标准品含6～7个浓度。

10.如权利要求1所述的引物对、权利要求2所述的探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测可复制性慢病毒的诊断剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测可复制性慢病毒的探针、引物、试剂盒及其应用。所述试剂盒包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明建立的检测方法具有较高的灵敏度，假阳性低，可联合细胞培养法应用于CAR‑T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞样品中的可复制性慢病毒检测，也可用于已有RCL安全性数据积累的CAR‑T细胞样本的快速放行检测，本发明的试剂盒可有效的作为细胞治疗产品生产环节中的质控手段。

技术研发人员：吴晓双,杨志行,宗伟英,贾敬,张月
受保护的技术使用者：湖州申科生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13