一种三七总皂苷的分离纯化方法与流程

1.本发明涉及天然产物分离纯化领域，具体涉及三七总皂苷的不依赖树脂层析的纯化富集方法。


背景技术：

2.三七为五加科人参属植物，又名田七、参三七，为传统珍贵药材。目前发现其含有皂苷、多糖、黄酮类、挥发油和氨基酸等在内的至少两百多种活性化合物， 其根、茎、叶、花均可入药， 目前《国家基本药物目录》和《国家中药保护品种目录》中至少有二十余种制剂含有三七组分。现代药理学表明三七不但具有止血、扩张血管、活血化瘀药理作用，还有着降低心肌耗氧量、抑制血小板凝聚、扩张冠状动脉、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成等活性。 其中，三七总皂苷（pns）具有良好的活血化瘀作用，抗炎作用，心肌保护作用等。
3.作为三七的主要有效活性成分，三七总皂苷成分较杂，含有多种单体皂苷，主要成分有三七皂苷r1、人参皂苷rg1、rb1、rd、re等，其中以人参皂苷rg1和rb1较多。《中国药典》规定：三七总皂苷按干燥品计算，人参皂苷rg1不得少于25％、人参皂苷rb1不得少于30％，且三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rd总量不得低于75％(口服用)。
4.皂苷类物质的常规预提取方法有加水煎法、有机溶剂回流提取法、渗漉法等，以及有微波提取、超声提取法等；已经比较成熟。
5.但是，对于三七总皂苷分离纯化工艺，精制的方法不多，种类主要包括色谱法、层析法和结晶法等。硅胶柱色谱与凝胶柱色谱法可以纯化得到高纯度的皂苷成分， 但其操作复杂，成本高，不适合工业化生产。
6.其中柱层析法例如可以采用硅胶、氧化铝、大孔吸附树脂等，其中大孔树脂吸附分离工艺操作简便，成本较低，使用最广。也是目前工业化生产采用的主要方法。
7.但是树脂吸附分离技术存在如下缺点：（1）分离得到的产品纯度不高，适合粗分离或初步分离。为了得到高纯度产品，需要进行再次或多次吸附分离。造成大量的损耗。使得分离产率较低。（2）特异性分离效果差，分离效果严重依赖上柱样品纯度。即，对上柱液的纯度要求较高，杂质含量越多分离效果越差，因此通常需要经过一系列前处理进行初步纯化才能上柱。
8.在现有技术中，示例性地，cn107669721a对三七粗粉进行酶解后，将酶解物进行水提以及多级逆流醇提， 然后采用大孔吸附树脂吸附处理，得到三七总皂苷的收率约在80％。cn104800258a将三七药材粉碎成粗粉，多功能提取罐中加6-8倍量的水，再加入乳化剂混匀，然后回流提取；然后提取液再过大孔吸附树脂，尽管提取物收率提高了30％，但是纯度仍然未获得明显提升。
9.因此，现有技术中采用大孔树脂吸附存在的工业化生产损耗大、产品纯度不高的缺陷难以克服。
10.面对传统工艺的不足，有必要寻找到一种操作简单、要求低、成并适用于大规模工
业生产的三七总皂苷提取及分离纯化方法。
11.申请人在与集团兄弟公司的合作研发中发现，可以通过特定的盐析步骤结合硅胶柱层析实现高纯度三七总皂苷的低损耗提取分离，可以用于护肤品添加剂，从而避免了采用两次或多次硅胶柱层析带来的高损耗。但遗憾的是，该工艺仍需要结合柱层析以实现高纯度产品的分离。
12.因此，在面对成分复杂的三七提取物时，现有技术的工业化生产难以从其中直接大规模纯化分离得到高纯度的三七总皂苷。
13.综上，基于三七粗提原料，开发不依赖柱层析或树脂纯化的分离纯化工艺，且成本低廉、适合大批量快速纯化且产品收率和纯度较高的三七总皂苷提取分离技术具有重要的应用价值和市场价值。


技术实现要素：

14.针对现有技术中从三七提取液中分离三七总皂苷存在的分离效率低、消耗大、产物纯度低以及难以大批量低成本工业化分离等问题，本发明提供了一种不依赖柱层析的基于梯度盐析-固相萃取相结合的三七总皂苷提取分离工艺。
15.具体地，本发明的首要目的是提供一种三七总皂苷提取物的制备方法。
16.所述方法针对三七总提取物采用梯度盐析、分子蒸馏和固相萃取联合手段，具有快速分离、成本较低、纯度高的优点，适合工业化生产；且产品提取率和纯度较高。
17.本发明的另一目的在于提供上述分离纯化得到的三七总皂苷提取物精制品，其具有不低于90%的hplc纯度，优选为不低于95%的纯度。
18.本发明方法采用的主要技术方案为：对初提后的三七总皂苷粗提物进行分子蒸馏获得轻相组分，再采用特定体系的梯度盐析、微球吸附相结合（固相萃取）的手段，从而提高三七总皂苷产品的纯化效率和纯度，并有效降低产品损耗（无需采用层析工艺），适合工业化生产。
19.其中，所述梯度盐析至少包括在两段不同ph下进行的盐析处理；其中，初次盐析ph优选5.0-6.0，二次盐析ph不低于6.5，优选不低于6.8。
20.进一步地，盐析处理后对所得盐析物用醇溶液（优选乙醇或丁醇）进行重结晶，从而得到纯化的三七总皂苷固体。优选地，三七总皂苷的含量不低于95%。
21.具体地，本发明的技术方案如下。
22.第一个方面，本发明提供一种三七总皂苷提取物的分离纯化方法，包括以下步骤s1-s4：步骤s1：提取预处理，制备三七总皂苷粗提物将干燥的三七粉用有机溶剂法进行常规提取，得到三七总皂苷粗提物。优选采用含醇的水溶液进行提取。
23.三七总皂苷的提取方法是本领域熟知的。
24.优选地，按照如下步骤进行：将经过清洗、干燥处理的三七药材（优选干燥的根）粉碎至粒径0.2-0.5mm，用60-80%体积分数的乙醇溶液（在本技术方案中所有醇溶液的百分数都是指体积百分数）浸泡2-6h后（优选60-70℃下热浸，或置于摇床上震摇）,100-300w超声处理15-30min后，再采用回
流提取法进行提取：每次回流提取30-60min，至少提取两次，过滤，合并收集提取液；优选地，将合并的提取液以6000-8000rpm离心20-30min，收集上清液并减压蒸发浓缩至原药材量的1-2倍重量。
25.更优选地，所述提取还可以采用加速溶剂法，其中，加速溶剂法包括：其中加速溶剂提取条件为：以乙醇为溶剂，提取温度120-125℃，提取压力6-6.8mpa，提取时间25-45min。
26.步骤s2：分子蒸馏处理，去除大分子重相组分对于粗提物中的核酸、蛋白、部分多糖等大分子重相组分，可以通过分子蒸馏的方法快速与小分子轻相组分分离开来。
27.具体地，分子蒸馏纯化的步骤如下：取上述浓缩后的三七总皂苷提取物溶液，在分子蒸馏器中进行预热处理后进行分子蒸馏，蒸馏参数为：真空度为3-15pa，蒸馏温度150-180℃，蒸馏时间15-30min，冷凝温度4-10℃，刮膜转速300-400r/min；收集沿冷凝柱流出的轻相蒸馏组分。
28.优选地蒸馏参数为：3-10pa，蒸馏温度150-170℃，蒸馏时间30min。
29.优选地，将上述经过分子蒸馏的三七总皂苷产物经减压浓缩后进行冷冻干燥获得干粉状的三七总皂苷提取物固体，以备后续用去离子水溶解，以备使用。
30.该快速分子蒸馏步骤可以有效去除提取液中的重相组分例如蛋白质、核酸及大分子多糖等杂质；所得轻相组分经hplc法测定，其中三七总皂苷含量可高达70%左右。
31.经过上述分离之后，粗提物中的大分子重相杂质已经被分离开来，得到初步纯化的三七总皂苷产品，此时可进行进一步精制纯化。
32.步骤s3：梯度盐析处理将上述经过分子蒸馏处理的三七总皂苷提取物溶液用两段不同的ph进行两次盐析预处理，得到不同程度钠盐化形态的三七总皂苷析出物，从而将富含羟基的三七总皂苷最大化程度地盐析出来。
33.其中，初次盐析ph优选5.0-6.0（更优选5.0-5.5），二次盐析ph 优选6.5-7.5，更优选ph6.8-7.2。
34.具体步骤如下：s3-1）：水浴加热下将得到的三七皂苷总提物固体用去离子水恰好溶解以得到接近饱和的溶液，向其中加入氯化钠至3-5wt%，并用碳酸钠调ph至5.0-6.0(使之以不完全钠盐形态析出)，室温下搅拌1-2h后置于冰浴条件下充分盐析，过滤，得到初次盐析固体；母液回收套用，盐析收率约为90%；s3-2）：二次盐析：将上述盐析所得粗品用50-60℃去离子水恰好溶解，加入氯化钠至3-5wt%，用氢氧化钠溶液调ph至6.8-7.2，室温下搅拌1-2 h，置于冰浴条件下充分盐析后过滤，得到二次盐析固体物；母液回收套用；s3-3）：60℃水浴加热下将二次盐析物用醇溶液（优选50-60%乙醇或丁醇溶液）恰好溶解，用盐酸调ph至2-4，在冰浴条件下搅拌降温结晶，过滤，得到纯化的三七总皂苷固体。
35.取上述制得的总皂苷提取物，溶于色谱纯甲醇，用纳滤滤头过滤后进行hplc分析，测得三七总皂苷的含量可达95%以上，盐析总收率80%以上。
36.步骤s4：功能化磁性微球富集及除盐处理由于盐析所得产品含有少量盐及微量非皂苷类小分子，因此该步骤中，采用表面含有羟基或氨基官能团的磁性微球进行进一步富集及除盐处理。
37.其中，所述磁性微球不受种类限制，优选表面富含氨基或羟基或羧基或上述基团表面改性的微球（例如市场上常见的聚苯乙烯微球，聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，或硅胶基质微球，或聚乙烯醇磁性微球，等；其制备方法也是本领域熟知的），优选粒度10-50微米的那些。
38.进一步地，本发明优选采用氨基功能化修饰的硅胶基质磁性微球和/或氨基功能化聚苯乙烯磁性微球（具体型号不受限制，可商购获得，例如，粒度为20-50微米）。
39.具体操作如下：1）向去离子水中滴加盐酸或硫酸调配溶液至ph 3-4，加入磁性微球至5-15wt%，搅拌分散；然后加入上述盐析后的固体使其充分溶解（恰好溶解即可，也可适当水浴加热促进溶解），然后震荡吸附1-3h；磁性条件下分离微球。
40.优选地，可将新的磁性微球置于上述母液中重复上述震荡吸附操作至溶液中基本不含三七皂苷r1(残留量低于总量1%)，合并得到三七皂苷r1吸附微球；进一步优选地，磁性微球的质量为皂苷质量的5-15倍。
41.2）将上述吸附皂苷后的微球合并后，加入至c1-c4烷基醇（优选丁醇，甲醇，乙醇）中进行搅拌或震荡15-30min以解吸附，通入磁场分离微球，所得溶液减压浓缩，真空干燥得到三七总皂苷，从而完成富集及除盐后处理，总皂苷纯度含量可达96%以上。
42.该步骤中，由于磁性微球表面富含的羟基、氨基等表面基团，与富含羟基的三七皂苷类分子产生较强的氢键键合等分子间作用力，进而与其他少量小分子非皂苷类杂质分离开来。
43.另外，相比硅胶层析，磁性微球粒径分布均匀，富集及解吸速率较快，适合工业规模生产；相比较单纯的大孔树脂等吸附层析，分离损耗小，整个除盐及富集过程更加高效、快速，大大节省溶剂。
44.其中，除了商购获得，表面修饰的磁性微球也可以按照本领域已知的微球表面修饰方法进行，例如：取pmma磁性微球、低级烷基胺例如乙胺/二胺和硅烷偶联剂分散于醇溶剂中，水浴加热反应6-12h即得。
45.示例性地，采用表面富含官能团的微球颗无需表面修饰，例如常见的pva微球，其制备流程如下：称取适当摩尔比（例如为1:2-3）的氯化亚铁、氯化铁混合原料溶解于去离子水中，搅拌均匀后加入到pva溶液中，搅拌下加入液体石蜡或吐温搅拌均匀，分批加入浓氨水，加入完毕后继续搅拌反应；反应完毕后冷却至室温，离心或磁性分离微球，去离子水洗涤微球颗粒，得到聚乙烯醇磁性微球。
46.第二个方面，本发明提供上述方法纯化得到的三七总皂苷提取物，其具有不低于95%的含量纯度，优选不低于97%的含量纯度。
47.与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：1）本发明的无需采用树脂层析纯化，不采用层析操作即可获得95%含量以上的三七总苷纯化效果，其损失的皂苷量少，成本低，周期短。适用于工业化生产。
48.2）相比较单次盐析操作，本发明加入了氯化钠促进析出，通过ph梯度调节，可以显
著提升盐析产品纯度，可达到95%以上。再结合微球吸附除盐处理即可得到高纯度的三七总皂苷（避免了现有技术中多次树脂层析带来的较大损耗）。
49.同时，本发明纯化方法也克服了现有色谱纯化方法无法批量获得高纯度三七总皂苷的弊端（尽管其也可以获得高的纯度，但是微升和毫升级别的上样量不适合工业化规模处理）。
50.3）本发明方法的处理原料为三七粗提液，由于含水的醇溶液特性所致，其中含有的成分较杂，既有各种水溶性成分，也有各种醇溶性成分，而现有的纯化方法中，通常采用萃取和树脂层析分离方法，但是由于三七总皂苷具有水溶和醇溶的双重溶解特性，使得萃取纯度较差，保留了大量的其他醇溶性杂质，导致后续的柱层析分离分离效率较低（而且树脂层析效率严重依赖上样原料纯度，在原料纯度较低的情况下其分离效率较差）。而本发明通过分子蒸馏预处理的处理手段，可以有效去除大分子重相组分。
51.本发明在后处理步骤创新性采用官能化磁性微球的富集方式，操作简单快捷、适合大批量操作；克服了柱层析吸附量小、效率低的缺陷。通过提高微球的用量，适合大批量工业化分离操作，效率高。
52.同时，磁性微球富集所用溶剂少且可循环使用，减少溶剂的消耗，生产成本低。
53.4）本发明纯化方法适用的提取原料纯度范围广（无需考虑提取溶液纯度），三七根茎叶等部位提取均可适用。另外，由于本发明纯化工艺利用了三七总皂苷的各种单体结构具有的相似性（例如具有多羟基基团）和共有结构单元，进而与杂质分离，其纯化工艺避免了树脂层析导致的各单体皂苷提取的差异性，最大程度保留了总皂苷的天然含量比例。
附图说明
54.图1为本发明实施例1得到的三七总皂苷产品的hplc谱图。
55.图2为本发明实施例1得到的三七总皂苷产品的外观形貌图。
具体实施方式
56.下面通过具体的制备例和实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
57.除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
58.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
59.以下实施例中，采用的循环水式真空泵购自巩义予华仪器公司，真空干燥箱型号dzf-6030。除本发明制备例自制的原料，其它原料为本领域常规原料，均来自于市售。
60.制备例1制备三七总皂苷粗提液1将约1kg干燥的三七药材（主根茎部位，购自云南向辉有限公司）粉碎至约0.2-0.3mm，用70%体积分数的乙醇溶液约6l热浸5h后（60℃热浸，于摇床上50rpm频率震摇），然后经300w超声处理15min，再采用两次回流提取法进行提取：每次回流提取30min，过滤，合
并收集提取液；将合并的提取液以6000rpm离心20min，收集上清液并减压蒸发浓缩至约800ml，制备得到三七总皂苷粗提液（粗提液中各种成分复杂，实际操作中无法通过做hplc测定总皂苷准确含量）。
61.制备例2制备三七总皂苷粗提液2将约1kg干燥的三七药材（根茎部位）粉碎后用60%体积分数的乙醇溶液约8l浸泡6h后（于摇床上50rpm频率震摇），经200w超声处理20min，再采用两次回流提取法进行提取：每次回流提取30min，过滤，合并收集提取液；收集上清液并减压蒸发浓缩至约1000ml，制备得到三七总皂苷粗提液。
62.实施例11）取上述浓缩后的三七总皂苷提取物溶液1，分批在分子蒸馏器中进行预热处理至100℃后进行分子蒸馏，蒸馏参数为：真空度为5pa，蒸馏温度150℃，蒸馏时间25min，冷凝温度4℃，刮膜转速300r/min；收集沿冷凝柱流出的轻相蒸馏组分。将上述经过分子蒸馏的三七总皂苷产物经减压浓缩后进行冷冻干燥获得淡黄色干粉状的含三七总皂苷提取物的固体约118g。所得轻相组分经hplc法粗略测定，其中三七总皂苷含量约74%。
63.经过上述分离之后，粗提物中的大分子重相杂质已经被大部分离开来，可进行进一步的盐析精制纯化。
64.2）盐析处理：2-1）：60℃水浴加热下将上述三七皂苷总提物用去离子水使其恰好溶解得到饱和溶液，向其中加入氯化钠至3wt%，并用碳酸钠调ph至6.0，室温下搅拌1h后置于冰浴条件下充分搅拌，静置盐析2h后过滤，得到一次盐析物；母液回收套用；2-2）：二次盐析：将上述一次盐析粗品用60℃去离子水恰好溶解，加入氯化钠至5wt%，用氢氧化钠溶液调ph至7.2，室温下搅拌1 h，置于冰浴条件下充分盐析后过滤（滤液回收套用），得到三七总皂苷的二次盐析物粗品（hplc纯度约92%）；2-3）：60℃水浴加热下将二次盐析物用60%乙醇溶液使其溶解，用盐酸调ph至3，在冰浴条件下搅拌降温结晶，过滤，真空干燥，得到三七总皂苷固体约87.4g，hplc含量约为95.1%；按理论含量计实际总收率约86%。
65.3）功能化磁性微球富集及除盐处理向1l去离子水中滴加硫酸调配硫酸溶液至ph 4，加入氨基化聚苯乙烯磁性微球（西安齐岳生物科技有限公司，粒度20微米）120g，搅拌分散；然后加入约10g上述盐析后的三七总皂苷固体使其充分溶解，80rpm下震荡吸附2h；吸附完毕后，通入磁场，磁性条件下分离微球。
66.进一步地，将新的磁性微球50g置于上述母液中重复上述震荡吸附操作至溶液中基本不含三七皂苷r1(残留量低于总量1%)，合并得到三七皂苷r1吸附微球；将上述吸附皂苷后的微球合并后，加入至350ml无水甲醇中进行震荡15min以解吸附，通入磁场分离出微球（所得微球可直接重复利用，其部分微球表面含有的少量未解吸附的皂苷分子对于重复利用没有影响），将所得溶液减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯化的三七总皂苷约8.8g。取样检测，总皂苷的hplc含量约97.8%（其中rg1 约39 .6％，rb1 33 .8%）。取样样品的hplc指纹谱图参见附图1；固体产品的外观形貌参见附图2。
67.hplc检测流程参照我国《药典》2015年版高效液相色谱法规定的方法进行。 色谱条件（下同）：柱子：c18，250mm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；流动相60%乙腈水溶液。
68.实施例21）取上述浓缩后的三七总皂苷提取物溶液2，分批在分子蒸馏器中进行预热处理至100℃后进行分子蒸馏，蒸馏参数为：真空度为10pa，蒸馏温度170℃，蒸馏时间20min，冷凝温度4℃，刮膜转速400r/min；收集沿冷凝柱流出的轻相蒸馏组分。将上述经过分子蒸馏的三七总皂苷产物经减压浓缩后进行冷冻干燥获得干粉状的含三七总皂苷提取物的固体。所得轻相组分经hplc法粗略测定，其中三七总皂苷含量约72%。
69.2）盐析处理：2-1）：50℃水浴加热下将上述三七皂苷总提物用去离子水使其恰好溶解得到饱和溶液，向其中加入氯化钠至4wt%，并用碳酸钠调ph至5.0，室温下搅拌1h后置于冰浴条件下充分搅拌，静置盐析2h后过滤，得到一次盐析物；母液回收套用；2-2）：二次盐析：将上述一次盐析粗品用50℃去离子水恰好溶解，加入氯化钠至5wt%，用氢氧化钠溶液调ph至6.8，室温下搅拌1 h，置于冰浴条件下充分盐析后过滤（滤液回收套用），得到三七总皂苷的二次盐析物粗品（hplc纯度约90.2%）；2-3）：60℃水浴加热下将二次盐析物用60%乙醇溶液使其溶解，用盐酸调ph至3，在冰浴条件下搅拌降温结晶，过滤，真空干燥，得到三七总皂苷固体约85.2g。
70.3）功能化磁性微球富集及除盐处理向1l去离子水中滴加硫酸调配硫酸溶液至ph 4，加入氨基化聚苯乙烯磁性微球（同上）100g，搅拌分散；然后加入约10g上述盐析后的三七总皂苷固体使其充分溶解，60rpm下震荡吸附1h；吸附完毕后，通入磁场，磁性条件下分离微球。
71.将新的磁性微球50g置于上述母液中重复上述震荡吸附操作至溶液中基本不含三七皂苷r1（残留量低于总量1%），合并得到三七皂苷r1吸附微球；将上述吸附皂苷后的微球合并后，加入至300ml乙醇中进行震荡15min以解吸附，通入磁场分离出微球（所得微球可直接重复利用），将所得溶液减压浓缩，真空冷冻干燥得到纯化的三七总皂苷约8.7g，hplc含量约97.3%。
72.对比例11）按照上述制备例1的方法制备三七总皂苷提取液；取100ml用0.22μm滤膜过滤，真空蒸发干燥，加入500ml无水乙醇中进行醇沉除杂（冰浴条件下），过滤弃去固体杂质，将滤液真空蒸发干燥，得到除杂的三七总皂苷粗品。
73.2）55℃水浴加热下将上述三七总皂苷粗品用150ml去离子水溶解，并用稀盐酸调ph至4.0，作为大孔吸附树脂柱(dm130，内径:柱床高度＝1:5.5；使用之前用乙醇浸泡24h，再用去离子水平衡)上样溶液。分批上样，上样流速为2bv/h，采用1-1.5bv去离子水冲柱后进行洗脱，洗脱液依次为50%、75%乙醇，洗脱速度为2bv/h，收集含皂苷组分的洗脱液，tlc检查洗脱终点。合并洗脱液，加入活性炭（2wt%）加热回流脱色15min。脱色后进行真空蒸发干燥，得到三七总皂苷纯品约7.6g，hplc测得总皂苷含量80.8%（面积法）。
74.对比例2在对比例1方法的基础上，进一步按照步骤2）的方法重复进行树脂层析分离，从而得到对比实施例2。脱色后进行真空蒸发干燥，得到三七总皂苷纯品约6.8g，hplc测得总皂
苷含量87.8%（面积法）。
75.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。