可高效分解多环芳烃的假节杆菌及其应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一株可高效分解多环芳烃的假节杆菌及其应用。


背景技术：

2.多环芳烃类化合物是典型的石化污染物。自然活动(森林火灾、火山爆发)和人为活动(石油泄漏、废气排放等)均能产生多环芳烃，人为活动是造成其产生与污染的主要因素。多环芳烃在水、土壤、空气等自然环境中广泛存在，且具有强烈三致效应，生物累积效应强，直接威胁着生物体和人类的健康。菲是典型的稠环类多环芳烃化合物，分布广泛，环境污染程度高，常被用作监测多环芳烃污染的指标。
3.目前，微生物降解是修复多环芳烃污染的主要与有效方法，近年来发展迅速，应用前景广阔。与物理法和化学法相比，由于微生物资源丰富，易于培养，因此，微生物修复技术的成本低，操作简单，且二次污染小。其中，微生物降解多环芳烃化合物的核心是筛选获得具有环境适应性好、降解效能高的多环芳烃降解菌株，这也是实现微生物修复实际环境中多环芳烃污染的基础。此外，由于实际的多环芳烃污染环境中往往混杂有重金属成分，这就要求筛选的菌株既能高效降解多环芳烃，也能有效耐受高重金属环境。因此，筛选鉴定可在重金属条件下有效降解多环芳烃的微生物菌株，将有助于推动多环芳烃污染环境的有效生物修复。
4.中国专利cn104946568a公布了一株耐重金属的多环芳烃降解菌、组合物及其用途。所述菌为浅黄分枝杆菌mycobacterium gilvum，保藏号为cgmcc no.10941。所述菌可用于去除或降解多环芳烃，尤其是去除或降解土壤、水环境中的多环芳烃；还可以用于在多环芳烃污染的土壤、水环境中生物修复，尤其是重金属及多环芳烃复合污染的土壤或水。同时所述菌与表面活性剂协同可增强去除或降解多环芳烃的能力。然而，该菌株的降解效率并不是很好，当多环芳烃含量均为50mg/l的情况下，菌株在第四天对菲的降解率仅在92.1。
5.中国专利cn102943052a公开了一株降解多环芳烃的克雷白氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniaetzyx1)及其在复合污染土壤修复中的应用。该菌株为克雷白氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)tzyx1，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为cctcc m2012239，具备降解多环芳烃的能力。然而，该菌株的降解效率并不是很好，专利中记载在15d后kl+m处理土壤多环芳烃的降解率为：萘86.6％、菲91.0％。
6.中国专利cn113583899a公开了一株鞘氨醇菌属多环芳烃降解菌株jt-m9-h及其应用专利申请事宜。该菌株命名为鞘氨醇菌jt-m9-h，sphingbium sp.jt-m9-h，其保藏编号为cctcc no：m2021248；于2021年3月18日提交地址位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行保藏。然而该专利仅给出了低浓度的菲(初始浓度分别为80和20mg/l)的处理效果，并没有涉及高浓度菲的处理效果。
7.因此，现有技术中公开的分解多环芳烃的菌降解效率和底物耐受能力都有待提高。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一株可高效分解多环芳烃的假节杆菌及其应用。该假节杆菌可在重金属条件下稳定高效分解多环芳烃，具有修复多环芳烃污染环境的应用潜能。
9.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
10.本发明首先提供一株可高效分解多环芳烃的假节杆菌，命名为l1sw，其已于2022年08月17日在中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc25541。
11.本发明所提供的假节杆菌l1sw来源于兰州石化公司石油炼化场地污染土壤，经过人工富集与筛选分离获得。l1sw菌落呈圆形，隆起，菌落呈乳白色，不透明，革兰氏染色呈阳性，单个或成对，好氧，30℃下生长良好。经对该菌株的16s rdna的鉴定与序列分析，表明该菌株为假节杆菌(pseudarthrobacter)。
12.本发明还提供所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌的16s rdna，其序列如seq id no.1所示。
13.本发明还进一步提供所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌的获取方法，包括以下步骤：
14.a、采集石油炼化场地的污染土壤作为微生物源；
15.b、以多环芳烃为单一碳源，制备含500mg/l菲的100ml无机盐培养基，用盐酸调ph值至7.4，121℃灭菌20min；
16.c、待培养基温度降低到30℃左右时，按照3％的土壤接种量在超净台下接种；
17.d、在30℃、180r/min的恒温摇床培养箱中进行富集培养；
18.e、重复培养三次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后，再将菌株接种入上述无机培养基内驯化；上述操作重复多次，得到纯化的假节杆菌，命名为l1sw。
19.在上述假节杆菌的获取方法，优选地，所述无机盐培养基的成分及浓度如下：k2hpo4·
3h2o，13.75g/l；kh2po4，4.5g/l；(nh4)2so4，2.0g/l；mgso4·
7h2o，0.16g/l；feso4·
7h2o，0.005g/l；cacl
2.
2h2o，0.011g/l；mncl2·
4h2o，0.002g/l。
20.本发明进一步提供所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌的应用，所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌用于分解多环芳烃。
21.进一步地，所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌用于重金属环境中多环芳烃的分解与去除。
22.在本发明的一个实施方式中，所述重金属环境为土壤环境或水体环境。
23.在本发明的一个实施方式中，所述重金属离子为cu、cd、pb、zn、as中的一种或一种以上。具体地，所述重金属条件可以为含有50-100mg/l锌离子的环境，例如为含有65mg/l锌离子。
24.在本发明的一个实施方式中，所述多环芳烃为萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘中的一种或一种以上。优选地，所述多环芳烃为菲。
25.本发明所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌以多环芳烃(优选菲)为唯一碳源。
26.本发明进一步提供一种菌剂，所述菌剂中含有所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌。
27.在本发明的一个实施方式中，所述菌剂中还含有表面活性剂。
28.本发明还提供一种去除重金属环境中多环芳烃的方法，采用所述可高效分解多环芳烃的假节杆菌去除重金属环境中多环芳烃。
29.本发明的假节杆菌l1sw菌株可在含5g/l的多环芳烃的培养基中以多环芳烃为唯一碳源正常生长，可耐受高达65mg/l的锌离子。该菌株能在60小时内将初始浓度为500mg/l的菲完全分解，3天内对3g/l、4g/l，5g/l菲的分解率分别达到95％、77％、57％。
30.依据本发明，假节杆菌pseudarthrobacter l1sw菌株具有在重金属条件下高效降解多环芳烃物质的特性，可应用于含此类污染物的复合污染环境的治理与修复。本发明所述菌株与已发现的多环芳烃降解菌株相比，其降解效率和底物耐受能力更高，环境适应性更好。
附图说明
31.图1为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw的平板划线图；
32.图2为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw以低浓度(50mg/l；250mg/l；500mg/l)菲为单一碳源时菌株的生长曲线；
33.图3为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw以高浓度(3g/l；4g/l；5g/l)菲为单一碳源时菌株的生长曲线；
34.图4为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw对低浓度(50mg/l；250mg/l；500mg/l)菲的降解曲线；
35.图5为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw对高浓度(3g/l；4g/l；5g/l)菲的降解曲线；
36.图6为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw在不同锌离子浓度(0.65mg/l；6.5mg/l；32.5mg/l；65mg/l)下对250mg/l菲的降解情况；
37.图7为本发明的假节杆菌pseudarthrobacter l1sw在不同锌离子浓度(0.65mg/l；6.5mg/l；32.5mg/l；65mg/l)下，以250mg/l菲为唯一碳源的生长情况。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
39.实施例1
40.一、假节杆菌pseudarthrobacter l1sw的获取与保藏
41.采集兰州石化公司石油炼化场地的污染土壤作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有500mg/l多环芳烃的无机盐培养基，按照3％的土壤接种量接种于含有100ml上述无机盐培养基的250ml三角瓶中，所述无机盐培养基的成分如下：k2hpo4·
3h2o，13.75g/l；kh2po4，4.5g/l；(nh4)2so4，2.0g/l；mgso4·
7h2o，0.16g/l；feso4·
7h2o，0.005g/l；cacl2.2h2o，0.011g/l；mncl2·
4h2o，0.002g/l。用盐酸调ph值为7.4，高压灭菌锅121℃灭菌20min。待培养基温度降低到30℃左右时，在超净台下接种污泥。然后在30℃、180r/min的恒温摇床培养箱中富集培养7天。重复培养三次后，在固体培养基平板(琼脂20.0g/l)上反复划线培养，直至分离出单菌株。之后，再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可降解多环芳烃的l1sw菌株，平板划线图如图1所示。l1sw菌落呈圆形，
隆起，乳白色，不透明；革兰氏染色呈阳性，单个或成对，好氧，30℃下生长良好。经对该菌株的16s rdna的鉴定与序列分析，表明该菌株为假节杆菌(pseudarthrobacter)。该假节杆菌l1sw菌株已于2022年08月17日在中国微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为cgmcc25541。
42.二、假节杆菌pseudarthrobacter l1sw的鉴定
43.将分离出的l1sw菌株进行16s rdna序列的扩增、序列测定与数据库比对。利用基因组提取试剂盒(tiangen，北京)提取l1sw菌株的基因组dna，之后，利用16s rdna片段扩增与检测试剂盒(takara，大连)扩增该菌株的16s rdna片段并测定序列。菌株l1sw的16s rdna序列如seq id no.1所示。与ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，表明该l1sw菌株为假节杆菌pseudarthrobacter。
44.seq id no.1
[0045][0046][0047]
三、假节杆菌pseudarthrobacter l1sw菌株对多环芳烃的降解效能
[0048]
将pseudarthrobacter l1sw菌株划固体培养基平板，于30℃培养3天。挑取单克隆，分别接种于以50-5000mg/l的多环芳烃(菲)为唯一碳源的液体培养基中，30℃，180r/min恒温振荡培养箱中培养3-7天。采集不同时间点的2个3ml平行样品，一个样品利用紫外分光光度仪(uv-2100spectrophotometer，unic)测定600nm吸光度值，用以表示微生物生长情况，结果如图2和图3所示。另一个样品中加入等体积乙腈混溶，超声5min，用0.22μm滤膜过滤，取100μl过滤，过滤液注入进样瓶的内插管中。采用超高效液相色谱(uplc，agilent 1290)测定多环芳烃菲的残留量，色谱柱为zorbax eclipse plus c18反相色谱柱(5μm，4.6
×
150mm)。不同初始浓度的多环芳烃菲的残留浓度测定结果如图4和图5所示。菌株l1sw可在含5g/l的多环芳烃菲为唯一碳源的培养基中正常生长。该菌株能在60小时内能将初始浓度为500mg/l的菲完全分解，3天内对3g/l、4g/l，5g/l菲的分解率分别达到95％、77％、57％。该菌株在含65mg/l锌离子的培养基中仍能生长以菲为唯一碳源生长，且在96小时内完全降解250mg/l菲，结果如图6和图7所示。
[0049]
基于本技术实施例的记载，可以看出，假节杆菌pseudarthrobacter l1sw菌株具有在重金属条件下高效降解多环芳烃物质的特性，可应用于含此类污染物的复合污染环境的治理与修复。本发明所属菌株与已发现的多环芳烃降解菌株相比，其降解效率和底物耐受能力更高，环境适应性更好。
[0050]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。